Frontiers in Cellular Neuroscience

Introdução

células ganglionares da Retina (RGCs) relé visual de informações relacionadas do olho para o cérebro através de seus axônios, que coletivamente formam o nervo óptico (Laha et al., 2017). Lesões do nervo óptico induzidas por trauma, glaucoma ou doenças neurodegenerativas muitas vezes resultam em perda de funções visuais e, eventualmente, cegueira. Estratégias que promovem a sobrevivência do RGC e a regeneração do nervo óptico são ativamente perseguidas para reparar lesões neurais e restaurar a função visual. Como neurônios do sistema nervoso central (SNC), RGCs maduros reduziram significativamente a capacidade intrínseca de regenerar seus axônios após lesões traumáticas ou neurodegeneração, levando eventualmente à perda de visão (Chun e Cestari, 2017; Laha et al., 2017). Além disso, ao contrário dos neurônios do sistema nervoso periférico (SNP), várias moléculas inibitórias extrínsecas atuam para limitar a regeneração de axônios no SNC, incluindo a medula espinhal e os nervos ópticos (Geoffroy e Zheng, 2014). Estudos anteriores demonstraram que a remoção de factores inibitórios extracelulares, como o Nogo e os seus receptores, pode induzir uma ligeira regeneração do nervo óptico (Fischer et al., 2004; Su et al., 2008, 2009; Dickendesher et al., 2012). Em contrapartida, a eliminação da fosfatase e do tensin homolog (Pten) no RGCs, que impulsionou a capacidade intrínseca de regeneração axónica, promoveu uma regeneração robusta do nervo óptico, indicando novas vias promissoras para melhorar a regeneração do SNC axon (Park et al., 2008). Durante a última década, a manipulação de vários genes em RGCs tem sido mostrado para aumentar significativamente a capacidade intrínseca de regeneração axon de RGCs maduros, como Klf4 / 9 (Moore et al., 2009; Apara et al., 2017), Socs3 (Smith et al., 2009), B-RAF (O’Donovan et al., 2014), c-myc (Belin et al., 2015), GSK3ß (Guo et al., 2016; Miao et al., 2016), Lin28 (Wang et al., 2018), e P53 (Ma et al., 2019). Embora estes genes tenham sido mostrados para regular a regeneração do nervo óptico, quase nenhum deles sozinho poderia ser manipulado para induzir o crescimento in vivo de axon de longa distância. Para resolver este problema, estratégias combinatórias têm sido tentadas para estender os comprimentos de axônios regenerativos. Na verdade, os efeitos sinérgicos ou aditivos de múltiplas vias independentes na regeneração RGC axon foram mais dramáticos e sustentáveis, como a Zymosan/cAMP/Pten-deletion (Kurimoto et al., 2010), CNTF/Pten-deletation / Socs3-deletation (Sun et al., 2011), c-Myc/CNTF/Pten-deletation/Socs3-deletation (Belin et al., 2015), e Lin28/Pten-deletion (Wang et al., 2018). Em alguns estudos, foi relatado que a regeneração de axônios RGC poderia alcançar longa distância, atravessando o quiasma óptico e entrando no cérebro (Kurimoto et al., 2010; Sun et al., 2011; de Lima et al., 2012; Lim et al., 2016).

o próximo passo após a regeneração do nervo óptico de longa distância deve ser explorar como a função visual pode ser restaurada com orientação axónica adequada, sinaptogénese e transmissão da actividade neural. Até à data, a regeneração do nervo óptico de novo através do quiasma parece ser o gargalo para regenerar axões RGC para entrar no cérebro. Assim, poucos estudos utilizando a combinação de abordagens têm relatado muito limitado de reconexão entre feridos axônios do nervo óptico e das suas metas no cérebro, tais como o núcleo supraquiasmático (NSQ), o corpo geniculado externo (LGN), o colículo superior (SC), e outras áreas visual com um maior período de tempo após a lesão (de Lima et al., 2012; Bei et al., 2016; Lim et al., 2016) ou a realização da lesão no pré-quiasma (Li et al., 2015) ou do trato óptico (Bei et al., 2016). Embora ainda seja necessária uma confirmação adicional destes estudos, os resultados forneceram algumas provas de princípio de que a recuperação da função visual é possível após lesão do nervo óptico se cada passo do crescimento do axon, orientação, sinaptogénese e remielinação puderem ser alcançados. Aqui, nós revisamos o progresso recente em alcançar a reconexão das vias olho-A-cérebro e discutimos potenciais estratégias futuras para religar os circuitos visuais após lesões do nervo óptico.

a regeneração de axônios de longa distância pode ser alcançada através da manipulação combinatória de múltiplos Genes/vias

para restaurar a visão após lesão do nervo óptico, axônios feridos devem regenerar todo o comprimento das vias olho-cérebro, uma distância de mais de 8 mm do local da lesão para LGN e SC em ratos (Figura 1). A regeneração axónica de longa distância, como o primeiro passo da reconexão olho-cérebro, é crucial na restauração da função visual após lesão do nervo óptico. Até à data, a eliminação condicional de Pten sozinho em RGCs levou provavelmente à mais longa regeneração do nervo óptico às 2 semanas após a lesão (até 3 mm distal para o local da lesão; Park et al., 2008). As manipulações de outros genes, como listadas na Tabela 1, têm sido demonstradas para promover a regeneração modesta de axões RGC que atingem a região média do nervo óptico após lesão (Tabela 1). Para além da manipulação da expressão genética no RGCs, a libertação não mediada pelo RGC do CNTF (Leaver et al., 2006), oncomodulina em resposta à inflamação (Yin et al., 2006), ou potenciação IGF1 mediada pela Lin28 (Zhang et al., 2019), todos têm demonstrado estimular a regeneração do nervo óptico, isoladamente ou em conjunto com outros fatores. Além disso, um nível elevado de zinco nas células de amacrina após lesão do nervo óptico demonstrou contribuir para a morte das células de RGC e para a regeneração falhada, transferindo-se lentamente para o RGCs (Li et al., 2017). Como resultado, o transportador de zinco ZnT-3 (codificado por gene slc30a3) melhorou a sobrevivência e regeneração do RGC. Além disso, foi demonstrado que um nível aumentado de campo aumenta a regeneração do nervo óptico induzida pela oncomodulina (Kurimoto et al., 2010). Por último, um subtipo de RGCs demonstrou produzir uma glicoproteína fosforilada secretada, a osteopontina (OPN), que actua em conjunto com IGF1 ou BDNF, para melhorar a regeneração do nervo óptico (Duan et al., 2015).

embora várias abordagens tenham sido mostradas para promover uma regeneração substancial in vivo, o crescimento de um número suficiente de axônios através de toda a via ótica continua a ser um grande desafio. Assim, avanços recentes na regeneração RGC axon não só focaram na identificação de novos genes e vias, mas também revelaram que os tratamentos combinatórios com mecanismos subjacentes distintos resultaram em efeitos aditivos ou mesmo sinérgicos (Tabela 2). Até à data, a eliminação de Pten, juntamente com a manipulação de outros genes RGC ou fatores extracelulares, têm sido a estratégia combinatória dominante para promover a regeneração do nervo óptico de longa distância. Por exemplo, exclusão Socs3 (Sun et al., 2011), ativação da B-RAF (O’Donovan et al., 2014), c-Myc overexpression (Belin et al., 2015), dclk2 overexpression (Nawabi et al., 2015), hIL-6 expression (Leibinger et al., 2016), ativação STAT3/MEK (Luo et al., 2016), quelação de zinco (Li et al., 2017), or Lin28 overexpression (Wang et al., 2018), tem sido demonstrado que cada um tem efeitos sinérgicos/aditivos com a supressão de Pten na regeneração do nervo óptico. Além disso, os fatores extracelulares descritos acima foram todos combinados com a manipulação genética de RGCs, tais como cAMP/oncomodulin/Pten-deletion (Kurimoto et al., 2010), CNTF/Pten-deletation / Socs3-deletation (Sun et al., 2011). Além disso, foram também demonstrados os efeitos aditivos ou sinérgicos de outras estratégias combinatórias, como a knockdown do Klf9 combinada com quelação de zinco (Trakhtenberg et al., 2018) e crmp2 constitucionalmente ativos, combinados com uma atividade GSK3 melhorada (Leibinger et al., 2017). Acredita-se que tais efeitos combinatórios se devem a diferentes vias sinalizadoras a jusante desses genes e fatores. Com base em estudos anteriores, várias vias de sinalização têm mostrado desempenhar papéis importantes na transdução dos efeitos de promoção desses genes / fatores. Por exemplo, a sinalização GSK3/mTOR relacionada com o Fator de crescimento é ativada a jusante da deleção de Pten (Park et al., 2008; Leibinger et al., 2019), osteopontin (Duan et al., 2015), melanopsin (Li et al., 2016), Akt (Guo et al., 2016; Miao et al., 2016), ou Lin28 (Wang et al., 2018). Além disso, a via MAPK a jusante da B-RAF (O’Donovan et al., 2014) ou MEK (Luo et al., 2016) esteve envolvido. Além disso, a sinalização da citoquina Jak-Stat podia ser activada a jusante da CNTF (Müller et al., 2007), Socs3 deletion (Smith et al., 2009), ou exclusão Klf4 (Qin et al., 2013). Além disso, estudos recentes revelaram várias vias de sinalização novas que funcionam para promover a regeneração do nervo óptico, tais como a fosfatase de ácido fosfatásico (PAP) Lipin1 que induziu a regeneração através da regulação do metabolismo glicerolípido (Yang et al., 2020), a trombospondina-1 que se liga ao syndecan para promover a regeneração do nervo óptico (Bray et al., 2019), e a proteína Lim muscular da actina cross-linker (Levin et al., 2019). Vale a pena notar que muitos genes regulatórios de regeneração do nervo óptico podem simultaneamente regular múltiplas vias a jusante e as vias sinalizadoras a jusante também têm sido mostrados para crosstalk uns com os outros.

Coletivamente, é bem reconhecido que a combinação de moléculas com diferentes jusante caminhos resultaria em maior distância, axon regeneração. Assim, identificar novos fatores com novas vias de sinalização, especialmente fatores que podem regular várias vias, ainda deve ser uma das áreas focadas no campo. Além disso, é também muito importante explorar a combinação óptima de múltiplos factores com base nos seus mecanismos reguladores. Finalmente, deve-se notar que a maioria (>80%) dos RGCs morrem algumas semanas após lesão do nervo óptico (Wang et al., 2018; Tran et al., 2019), tornando a sobrevivência RGC um grande obstáculo para um número suficiente de axônios regeneradores necessários para a recuperação da função visual. Curiosamente, vários subtipos de RGCs têm mostrado diferir em sua capacidade de sobreviver ou regenerar axônios após lesão do nervo óptico (Duan et al., 2015; Norsworthy et al., 2017; Bray et al., 2019). Recentemente, um estudo sistemático utilizando RNA – seq unicelular revelou a vulnerabilidade seletiva dos subtipos de RGC após lesão axonal e forneceu evidências de que estratégias neuroprotetoras específicas do tipo poderiam ser críticas para a intervenção (Tran et al., 2019). Assim, genes / vias que agem para proteger RGCs ou subtipos da morte celular são igualmente importantes para serem identificados.

Orientação Adequada de Regeneração de Axônios Passando O Quiasma óptico e Entrar No Cérebro

Embora o combinatória abordagens após a lesão do nervo óptico poderia resultar em uma substancial de longa distância nervo óptico regeneração, o quiasma é emergente a ser o principal obstáculo para a regeneração de axônios para entrar no cérebro e chegar a seu original alvo de núcleos. Analisando a regeneração de axônios em pontos temporais posteriores após a lesão nervosa (ou seja, 4-10 semanas), em vários estudos usando abordagens combinatórias axônios regeneradores poderiam alcançar e até mesmo atravessar o quiasma óptico. Por exemplo, quando PTEN / Socs3 Double knockout foi combinado com CNTF, 4 semanas (Sun et al., 2011) ou 10 semanas (Luo et al., 2013) depois de lesões nervosas, muitos axônios regeneradores poderiam chegar ao final proximal do quiasma, mas pararam de crescer. Quando a expressão de C-Myc foi adicionada à combinação, mais axônios cruzaram o quiasma e cresceram nas extensões ópticas (Belin et al., 2015). Da mesma forma, outras abordagens combinatórias, como cAMP/Zymosan/Pten-deletion (de Lima et al., 2012; Luo et al., 2013), Lipin1-deletion/CNTF (Yang et al., 2020), e PTEN-deletion/MEK / STAT3 (Luo et al., 2016), Pode também induzir a regeneração do nervo óptico perto ou atravessar o quiasma óptico.

uma observação interessante de alguns destes estudos foi que muitos axônios regeneradores foram virados para trás no quiasma ou descarrilaram para longe do trato óptico após atravessar o quiasma. Esta observação sugere que o quiasma óptico apresenta um limite inibitório e a má orientação dos axônios ocorre no trato óptico. Com efeito, tal como já referido, a eliminação do Nogo e dos seus receptores no sistema visual resultou numa ligeira regeneração do nervo óptico, indicando a natureza inibitória do sistema visual Maduro. In an early study (Pernet et al., 2013a), usando a abordagem de limpeza de tecidos e imagens confocais de todo o nervo óptico mount, o estudo descobriu que muitos axônios regeneradores induzidos pela CNTF mostraram trajetórias irregulares, com muitas u-voltas dentro do nervo óptico. Em um estudo posterior do mesmo laboratório (Pernet et al., 2013b), regenerating RGC axons induced by active STAT3 also showed wandering trajectories with frequent U-turns. No entanto, quando os nervos ópticos foram adicionalmente tratados com o inibidor da Rho-cinase Y27632, os axônios regeneradores induzidos pelo Stat3 tornaram-se mais esticados e a taxa de U foi significativamente reduzida. Como o inibidor da Rho-quinase é bem conhecido por antagonizar os efeitos inibitórios do inibidor baseado na mielina (isto é, Nogo, MAG), estes resultados confirmaram a presença de moléculas inibitórias extracelulares no nervo óptico. Em suporte, através da remoção de tecidos e Microscopia Avançada de fluorescência em folha de luz (LSFM), três estudos (Luo et al., 2013; Yungher et al., 2015; Bray et al., 2017) realizou imagiologia 3D de alta resolução e análises morfológicas axonais detalhadas no nível axonal único. Especificamente, os resultados descobriram que dentro do nervo óptico a maioria dos axônios regeneradores tinha um caminho sinuoso e muitos deles fizeram curvas aguçadas. Para axões alcançando o quiasma, alguns axônios voltaram para o quiasma e entraram no nervo óptico oposto sem ferimentos, confirmando quiasma como uma barreira inibitória. No caso dos axões que conseguiram atravessar o quiasma, foram observados mais axões no tracto óptico ipsilateral do que no tracto contralateral, indicando má orientação de axon. Alguns axons foram identificados no SCN localizado diretamente acima do quiasma e nenhum axon foi observado nos alvos visuais mais distantes, LGN ou SC. Consistente com estes achados, nosso estudo recente usando a limpeza de tecidos e imagens 3D (Wang et al., 2018) mostrou que lin28 axons regeneradores RGC induzidos pela sobreexpressão também mostraram muitas voltas-U dentro do nervo óptico, que foi reduzido quando a expressão Lin28 foi combinada com knockdown de Pten. Além disso, o nosso último estudo (Wang et al., 2020) mostrou que eliminar a miosina IIA/B em RGCs por si só resultou em regeneração significativa do nervo óptico. Curiosamente, quando as trajetórias de axon foram examinadas com limpeza de tecidos e imagens 3D, em ratos de tipo selvagem, os axônios curtos e regenerados automaticamente seguiram trajetórias errantes com muitas voltas em U, enquanto em ratos nocaute miosin IIA/B os axônios regeneradores eram muito mais lisos com curvas em U muito reduzidas. Mais importante ainda, a combinação da sobreexpressão Lin28 com o nocaute da miosina IIA/B levou à regeneração do nervo óptico de longa Distância em 2 semanas após a lesão do nervo (até 4,5 mm do local da lesão). Porque o nosso estudo anterior (Hur et al., 2011) mostrou que apagar a miosina IIA/B permitiu o crescimento do axônio sobre dois substratos inibitórios principais, detritos de mielina e CSPGs, os novos resultados provaram que superar os sinais inibitórios no nervo óptico era uma abordagem promissora para uma regeneração mais eficiente do nervo óptico de longa distância.

finalmente, para melhor examinar como os axônios regeneradores se comportavam no quiasma óptico ,um estudo (Li et al., 2015) usou um modelo de lesão pré-quiasma, no qual a regeneração axons só precisava crescer uma curta distância para chegar ao quiasma. O estudo demonstrou que, 4 semanas após a lesão nervosa, muitos axônios entraram e passaram pelo quiasma, a maioria dos quais ocupava o lado ipsilateral do hipotálamo, incluindo o NCG. Às 8 semanas, mais axônios foram encontrados dentro da NCG. Uma descoberta importante foi que mesmo quatro meses após a lesão nervosa, quase nenhum axônio regenerador atingiu alvos cerebrais mais longe do quiasma óptico, como a OPN e o SC. Este estudo confirmou ainda que, sem sugestões de orientação adequadas, é difícil regenerar axônios para reinervar alvos cerebrais mais profundos.

em resumo, estes estudos sugeriram que mecanismos adequados de orientação axónica são necessários para regenerar axônios RGC para alcançar os seus núcleos alvo originais no cérebro e a subsequente recuperação visual funcional. Novas técnicas experimentais, tais como abordagens de limpeza de tecidos (3DISCO, claridade, etc.) e sistemas avançados de imagem 3D (microscopia multifotônica, LSFM, fMOST, etc.), estão emergindo como ferramentas úteis para a análise detalhada da trajetória axônica no cérebro.

Axon Regeneração do Olho para O Cérebro Resgatar Visual Parcial Comportamentos

Depois de regeneração de axônios alcançar seus original cérebro metas, o próximo desafio é atingir um novo synaptogenesis, remyelination, e a posterior restauração funcional da visão. Até à data, apenas alguns estudos relataram reconexão funcional com núcleos cerebrais após esmagamento do nervo óptico. Um estudo inicial mostrou que a combinação da deleção de Pten com Zymosan e cAMP resultou na regeneração axon de longa distância atravessando o quiasma óptico e em estruturas cerebrais, incluindo SCN, dLGN e SC, 10 semanas após a lesão do nervo óptico. Evidências histológicas demonstraram que terminais axon regeneradores pareciam formar sinapses dentro dos núcleos visados. Consequentemente, vários comportamentos visuais inatos foram parcialmente restaurados, tais como percepção de profundidade, resposta optomotora e padrões de atividade circadiana (de Lima et al., 2012). Num estudo posterior em que foi utilizada a mesma abordagem combinatória (Luo et al., 2013), whole-mount tissue clearing e 3D imaging analysis with LSFM showed that regenerating axons were indeed observed into and beyond the optic chiasma. No entanto, em contraste com o estudo anterior (de Lima et al., 2012), apenas alguns axônios foram observados alcançando a NCL e nenhum axônio regenerador foi encontrado além da NCL. Muitos axônios foram observados em lugares que não estavam associados com a via ótica, indicando má orientação de axon. No mesmo estudo, Socs3 / Pten Double knockout, juntamente com CNTF, foram usados para induzir regeneração axônica de longa distância. Da mesma forma, axônios regeneradores poderiam alcançar e atravessar o quiasma óptico e nenhum axônio poderia ser encontrado além do SCN. Para descartar a possibilidade de que o procedimento de remoção de tecidos possa branquear o sinal do rastreador CTB, foram examinadas seções cerebrais coronais regulares. Similarmente, o CTB rotulado axônios regeneradores foram encontrados principalmente na área do hipotálamo, incluindo o SCN, e nenhum axônio foi identificado nos alvos mais distantes, LGN e SC.

Em um estudo recente, aumentando a RGC a atividade neuronal e a ativação da mTOR sinalização (Rheb1 sobreexpressão) de longa distância, a axon regeneração e corrigir o pathfinding em todos os principais alvos visuais foram observadas tão cedo quanto a 3 semanas após a lesão do nervo óptico (Lim et al., 2016). Especificamente, em ratos recebendo estimulação visual e Rheb1 sobreexpressão de tratamento, recém-formado ligações foi parcialmente restaurar optomotor resposta optokinetic reflexo de análise (OKR), considerando que não conseguiu resgatá aluno a resposta, a percepção de profundidade, e o visual da resposta de medo (Lim et al., 2016). O estudo sugeriu que essa recuperação funcional parcial poderia refletir defeitos na formação de sinapses, números insuficientes de axônios regeneradores e/ou baixa precisão da localização interna do alvo. Em conjunto, até à data, existem poucos estudos (de Lima et al., 2012; Lim et al., 2016) relatou regeneração do nervo óptico de longa distância com recuperação parcial da função visual, entre os quais um estudo não poderia ser repetido em um estudo diferente (Luo et al., 2013). Assim, são necessários estudos adicionais para confirmar se, após lesão intraorbital do nervo óptico regenerando axônios RGC podem ser corretamente guiados para atingir seus alvos inervadores originais no cérebro.

Apesar dos avanços significativos na promoção do RGC axônios além do quiasma óptico para o cérebro após a lesão do nervo óptico, é difícil para explorar axon pioneiro em todo o quiasma e subsequente destino reinnervation devido ao número limitado de regeneração de axônios de atingir o cérebro. Para resolver tal problema, como mencionado acima em um estudo (Li et al., 2015) lesão do nervo óptico pré-quiasma foi realizada para que mais axons pudessem alcançar e atravessar o quiasma óptico. Neste estudo, seções em série revelaram que, após um período mais longo, axônios regeneradores poderiam ser identificados na região central da NSC. Ao centrar-se na NCG, o estudo utilizou anticorpos tanto contra o marcador pré-sináptico transportador vesiculoso glutamato 2 (VgluT2) como contra o marcador de densidade pós-sináptica Homer1 para rotular a nova formação de sinapse. Muitos pontos triplamente rotulados (CTB, VgluT2, Homer1) foram identificados, indicando sítios sinápticos excitatórios em regenerar axônios positivos de regeneração CTB. Experimentos adicionais usando vírus de pseudo-raiva codificando GFP forneceram evidências de que a regeneração RGC axons formou conexões com os circuitos cerebrais existentes. Por último, através da estimulação do pulso leve do olho ferido, a expressão do gene c-Fos foi observada na NCG após o tratamento, indicando sinapses funcionais reformadas na NCG. Além disso, gravações de grampo de células inteiras de neurônios SCN com estimulação do nervo óptico mostraram EPSCs evocados, confirmando conexões sinápticas excitatórias reformadas. Baseado na mesma lógica, outro estudo recente (Bei et al., 2016) adotou um modelo de transecção do trato óptico (proximal ao SC) que reduziu marcadamente a distância entre axônios regeneradores e o SC. Neste estudo, quer a combinação de PTEN / Socs3 Co-deleção com CNTF/BCL2 ou co-sobre-expressão de OPN/IGF1/CNTF, induziu regeneração do axônio retinocolicular e formação de sinapse funcional após a transeção do tracto óptico. No entanto, axônios regeneradores exibiram má condução elétrica e, portanto, não conseguiram restaurar a função visual significativa. É provável que uma razão potencial para a falência esteja associada à falta de mielinação. Os bloqueadores dos canais de potássio dependentes de voltagem (4-AP ou 4-AP-3-Me) foram utilizados para melhorar a condução em axões des-mielinados de doentes com esclerose múltipla. Como esperado, a aplicação aguda de 4-AP aumentou significativamente a condução elétrica, resultando em recuperação significativa da função visual. Juntos, estes dois estudos com lesão axónica perto dos seus alvos inervadores forneceram provas fundamentais de que, quando axônios regeneradores suficientes podiam atingir os seus alvos cerebrais, a formação sinapse e a restauração da função visual são possíveis.

Em resumo, os dados existentes até a data de apoio que: (1) com a combinatória abordagens, é possível induzir a longa distância axon regeneração entrar no cérebro; e (2) com a devida axon orientação e remyelination, a função visual pode ser restaurada (Figura 2). A via olho-A-cérebro contém múltiplas estruturas-alvo, que estão associadas a várias funções relacionadas com a visão, tais como o estado fisiológico animal, comportamentos reflexivos orientados visualmente, e a codificação de características visuais complexas (Dhande et al., 2015). Portanto, a solução ideal para a recuperação funcional após lesão do nervo óptico requer longa distância axon regeneração do sítio da lesão no cérebro, adequada axon orientação para chegar específico central núcleos, reforma do funcional sinapses com os objectivos adequados, e remyelination para habilitar a transdução de impulsos elétricos.

Perspectivas Futuras

Apesar do progresso significativo no RGC regeneração ao longo da última década, funcional reparação na via visual ainda tem um longo caminho a percorrer. Com base nos estudos acima descritos, uma questão importante é para onde devemos ir em breve. Primeiro, embora tenhamos identificado muitos genes que podem ser manipulados para melhorar a regeneração do nervo óptico, a nossa compreensão dos mecanismos celulares e moleculares pelos quais a regeneração axónica é regulada permanece fragmentada. Por exemplo, durante a maturação neuronal quais são os passos-chave e reguladores essenciais que gradualmente desligam a capacidade de crescimento do axônio? Quais são as principais diferenças entre neurônios no SNC que quase permanentemente perderam sua capacidade de suportar a regeneração axônica, comparando com aqueles no SNP que podem reativar sua capacidade intrínseca? De todos os neurônios no mesmo tecido, todos eles têm a mesma capacidade de suportar a regeneração axônica? Como outras células da retina, como as células Müller, as células amacrine, contribuem para a perda da capacidade de regeneração axónica dos RCG durante a maturação e a regeneração falhada após lesões? A abordagem multiómica recentemente desenvolvida, como a sequenciação RNA -, ATAC e Hi-C, tanto a nível bulk como a nível unicelular, apoiada pelas análises avançadas de Bioinformática, será uma ferramenta muito útil para abordar estas questões (Tran et al., 2019). Por outro lado, a rápida actualização dos sistemas CRISPR/CAS9-dCas9 (Liu et al., 2018; Tian et al., 2019) estão se tornando técnicas maduras e confiáveis, que podem ser usadas para tela funcional de alta capacidade de novos genes regulando a sobrevivência e regeneração de RGC. A aplicação destas novas técnicas não só nos ajudará a elucidar melhor os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração axon, como também nos guiará a descobrir novos genes e vias que regulam a sobrevivência e regeneração do RGC.

em segundo lugar, após a regeneração de axônios de longa distância, o próximo desafio é guiar os axônios regeneradores para atingir seus alvos específicos no cérebro, formar sinapses funcionais, remielinar os axônios adequados, e recuperar função visual específica. Infelizmente, a investigação actualizada nesta área continua a ser muito limitada. Embora alguns estudos tenham mostrado regeneração de longa distância dos axônios do nervo óptico de volta a todos os núcleos cerebrais e alguma recuperação da função visual, mais estudos são necessários para confirmar estes achados. Vários estudos anteriores (Luo et al., 2013; Yungher et al., 2015; Wang et al., 2020) têm mostrado claramente que imagens 3D de alta resolução no nível de axon único é uma abordagem ótima para seguir as trajetórias de regeneração axônios no cérebro.

Third, the current most used animal model of visual injury is the optic nerve crush that is surgically easy and reproducible. No entanto, várias doenças clinicamente relevantes resultam em lesões do nervo óptico, tais como glaucoma, neurite óptica, neuropatia óptica e atrofia do nervo óptico. Como diferentes doenças podem induzir diferentes respostas celulares, diferentes modelos animais imitando cada doença devem ser utilizados antes de uma potencial aplicação translacional.

contribuições dos autores

S-GY, C-ML, E F-QZ projetaram, escreveram, revisaram e finalizaram o manuscrito. C-PL editou o manuscrito. X-QP desenhou os números. A Z-QT forneceu comentários construtivos. Todos os autores lêem e aprovam a versão final do manuscrito.Para este trabalho, A F-QZ foi apoiada por subvenções do NIH (Instituto Nacional do olho).; National Institute of Neurological Disorders and Stroke; R01NS085176, R01EY027347, R01EY030883), The Craig H. Neilsen Foundation (259450), and the Birght Focus Foundation (G2017037). O C-ML foi apoiado por doações do Programa Estratégico de pesquisa prioritária da Academia Chinesa de Ciências (XDA16010302), do Programa Nacional de pesquisa e desenvolvimento chave da China (2016YFA0101402) e da Fundação Nacional de Ciência da China (91753140). O S-GY foi apoiado pela bolsa da Fundação Nacional de Ciência da China (81370051).

conflito de interesses

os autores declaram que a investigação foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.