Engenharia Reversa Aplicada ao Vermelho do Cabelo Humano Pheomelanin Revela Redox-Buffer como um Pró-Oxidante Mecanismo de

Inicial de Caracterização

sola do Sintéticas modelos de pheomelanin e eumelanin pigmentos foram investigadas no presente estudo, junto com o natural da melanina samples35. As melaninas sintéticas foram preparadas por oxidação enzimática da di-hidroxifenilalanina (dopa) e da 5-s-cisteinildopa, os principais precursores biossintéticos da eumelanina natural e da feomelanina, respectivamente. Amostras de melanina Natural foram purificadas do cabelo humano por procedimentos proteolíticos enzimáticos 9.

Caracterização química

caracterização química dos filmes melanina-quitosanos foram realizados usando espectroscopia Raman (figura S1 de Informações suplementares mostra imagens SEM para estes filmes). A figura 2a mostra que o espectro de eumelanina em pó sintético tem duas faixas características3. Banda 1 (1360 cm-1) e Banda 2 (1580 cm−1) que têm sido atribuídas ao alongamento linear das ligações C-C dentro dos anéis aromáticos e ao alongamento in-plano dos anéis aromáticos, respectively36,37. Estas duas bandas características também foram observadas quando eumelanina sintética foi aprisionada no filme chitosano (chitosan não mostra bandas nesta região espectral).

a caracterização Raman do pó sintético de feomelanina e da feomelanina encravada por película é mostrada na Fig. 2b. em comparação com o espectro da eumelanina sintética, o espectro Raman para estas amostras de feomelanina mostra dois picos proeminentes adicionais acima de 2000 cm−1 (Banda 3 e Banda 4). Estudos anteriores sugerem que estas bandas estão relacionadas com bandas sobretone ou combinação38. Estas bandas Raman também foram observadas tanto para as amostras de feomelanina sintética em pó como em filme.

espectros de Raman de amostras de melanina natural (figura S2 de Informações suplementares) exibem características que são consistentes com as observadas para pigmentos sintéticos,embora mais complexas devido à contribuição da proteína matrix36, 38. No caso das faixas de feomelanina naturais atribuíveis à eumelanina, podem ser identificadas 36, sugerindo a presença de uma componente significativa da eumelanina na feomelanina39 natural.

Engenharia Reversa Sintético Melanins

Inicial de Caracterização para Identificar Redox Atividade

Uma primeira caracterização eletroquímica dos sintético melanins foi realizada por imersão do filme-eletrodos revestidos, em um misto de solução de três mediadores redox (100 µM Ir3+, 50 µM Fc e 50 µM Ru3+) e a aplicação de uma cíclico potencial para subjacente eletrodo (entre -0.5 V e + 0, 8 V a uma velocidade de varrimento de 2 mV / S). As concentrações mediadoras utilizadas nestes estudos foram selecionadas com base em medições iniciais que serviram para” sintonizar ” as condições para obter sinais de saída úteis. Os resultados dos eléctrodos revestidos com quitosano com eumelanina encravada (91 µg/mL) ou feomelanina (104 µg/mL) foram comparados com um eléctrodo revestido com quitosano de controlo (sem melanina encravada). O voltammograma Cíclico (CVs)na Fig. 3a, B mostra quatro grandes regiões de interesse.

na região” A ” da Fig. 3a, b, o potencial foi varrido em uma direção redutora de 0 V para -0.5 V vs Ag/AgCl e o eletrodo agiu como uma fonte de elétrons. Nesta gama potencial, o mediador Ru3+ é eletrochemicamente reduzido a Ru2+ gerando uma corrente positiva (redutora). Para o eletrodo de controle revestido com quitosano, observa-se uma pequena corrente redutora e esta corrente é atribuída à redução eletroquímica de íons Ru3+ que se difunde através do filme para o eletrodo. Figo. 3a, b mostra uma amplificação considerável das correntes redutoras na região A para ambos os modelos de melanina. Esta amplificação é explicada pelo mecanismo redutor redox-cycling na parte superior direita do Figo. 1b. Especificamente, a espécie Ru2+ de redução eletroquímica se difunde no filme e transfere seus elétrons para a melanina entrapada, convertendo assim as moléculas de melanina oxidada em seus Estados reduzidos e regenerando o mediador ru3+ oxidado. Assim, a resposta de saída observada na região a (corrente de redução ru3+ amplificada) indica que a incorporação de qualquer uma das melaninas sintéticas confere atividade redox aos filmes.

na região “B”, o potencial é varrido por um potencial ligeiramente positivo permitindo que o eletrodo sirva como um sumidouro para elétrons. Sob esta condição, o mediador oxidante Fc Doa elétrons ao eletrodo para gerar a corrente negativa (oxidativa). Em comparação com o controlo quitosano, o eléctrodo revestido eumelanina-quitosano (Fig. 3a) mostra uma amplificação considerável da corrente oxidante na região B, que é explicada pelo mecanismo oxidativo redox-ciclismo na parte superior esquerda da Fig. 1b. neste caso, a espécie Fc+ eletroquímica oxidada é reduzida no filme aceitando elétrons da eumelanina entrapada (convertendo assim as moléculas eumelaninas reduzidas em seus Estados oxidados). O eléctrodo revestido com a película feomelanina-quitosana (Fig. 3b) mostra menor amplificação nesta região B em comparação com a amostra eumelanina.

na região “C”, o potencial é varrido para um potencial mais altamente positivo para permitir a oxidação de outro mediador oxidante Ir3+. Sob estas condições mais oxidativas, Ir3+ pode ser oxidado no eletrodo para gerar uma corrente negativa. A figura 3a, b mostra correntes de oxidação nesta região C são amplificadas para os filmes eumelanina e feomelanina. Analogous to the arguments above for the B region, the amplified oxidative currents in region C result from an oxidative redox-cycling mechanism in which Ir3+ shuttles electrons from the entrapped melanin to the electrode. Novamente, a resposta de saída observada (correntes de oxidação amplificadas nas regiões B E C) indica que a melanina confere atividade redox aos filmes.

na região “D”, o potencial é varrido na direção redutora de +0,4 V para 0 V, o que permite que Fc+ oxidado seja eletrochemicamente reduzido para Fc. A figura 3b mostra que as correntes de saída amplificadas são observadas na região D para a feomelanina, mas não para as amostras de eumelanina (Fig. 3a).

a primeira característica de resposta importante observada na Fig. 3 é a amplificação emparelhada das correntes de oxidação e redução que fornece evidência de que ambos os modelos sintéticos de melanina são redox-ativos. Especificamente, amplificações emparelhadas de correntes de oxidação e redução é uma assinatura característica do redox-cicling24 e sugere que as melaninas podem participar no ciclo redox oxidativo e redutor, sendo trocadas para um estado reduzido (aceitando elétrons dos mediadores; regiões A ou D) e para um estado oxidado (doando elétrons aos mediadores; regiões B E C).

uma segunda característica importante da Resposta da Fig. 3 é que as amplificações emparelhadas ocorrem em diferentes potenciais que sugerem que a eumelanina sintética e a feomelanina são oxidadas/reduzidas em diferentes potenciais. A termodinâmica restringe as reações redox de tal forma que os elétrons “fluem” de espécies com potenciais redox mais negativos para espécies com potenciais redox mais positivos. Esta restrição termodinâmica, juntamente com as observações experimentais, é usada para estimar a redução de potenciais para a eumelanina (Fig. 3c) e feomelanina (Fig. 3d) e da mesma forma para estimar os potenciais de oxidação (Fig. 3e, f). Eumelanin tem uma região amplificada redução (região A) e duas regiões da amplificado oxidação (regiões B e C), indicando que a redução-oxidação (redox) potencial preso eumelanin está entre colchetes na redução final pelo E° do Ru3+ (-0.2 V vs Ag/AgCl) e a oxidação final pelo E° da Fc (+0.25 V). A resposta de saída distintiva da amostra de feomelanina (amplificação da região D) indica que pode sofrer um ciclo redutor redox aceitando elétrons do Fc (e então doando-os para Ir3+). Isto fornece evidências iniciais de que a feomelanina é um oxidante mais forte com um potencial redox que é salobrado na extremidade redutora pelo e° de Fc (+0,25 V) e na extremidade oxidante pelo e° de Ir3+ (+0,55 V).

a Tabela 1 sugere reacções putativas redox para estas amostras de melanina. Propomos que a actividade redox da eumelanina envolva a oxidação de grupos de 5,6-diidroxiindol para formar quinones40 alargados. Propomos que a atividade redox da feomelanina esteja relacionada com os grupos de benzotiazina da feomelanina e reações putativas são sugeridas na tabela 141,42,43.

é importante notar que as características de resposta eletroquímica observadas indicam que ambas as melaninas sintéticas são redox ativas. Medições electroquímicas durante períodos prolongados (figura S3 de Informações suplementares) indicam que estas actividades redox são estáveis e que a melanina pode ser oxidada e reduzida repetidamente. Assim, embora a eletroquímica não forneça nenhuma informação química estrutural das moléculas individuais (quinona, semi-quinona e hidroquinona)32,44, indica que a distribuição entre estes estados é dinâmica dependendo do contexto ambiental.

estimando o potencial Redox

para confirmar as estimativas iniciais dos potenciais redox para as melaninas sintéticas, sondamos as amostras com dois mediadores redox para detectar respostas de saída (amplificação emparelhada das correntes de oxidação e redução) que caracterizam o ciclo redox. O ciclo redox contínuo requer pelo menos dois mediadores e os potenciais redox dos mediadores devem colocar o potencial redox da amostra. Assim, este teste permite estimar o potencial redox de uma amostra.

a figura 4a mostra as curvas de potencial actual para o feomelanina-quitosano e o eléctrodo revestido de quitosano de controlo numa solução mista de 100 µM Ir3+ e 50 µM Fc. Em comparação com o controle de quitosano, a amostra de feomelanina mostra uma amplificação emparelhada das correntes de redução na região D e correntes de oxidação na região C. Esta amplificação emparelhada sugere que a feomelanina pode passar pelo redox-cycling com Fc servindo como agente redutor e Ir3+ servindo como oxidante. Para o caso de eumelanin, Fig. 4b não mostra amplificação emparelhada, pois nenhuma redução amplificada é aparente. Estes resultados confirmam que o modelo feomelanina, mas não a eumelanina, tem actividade redox no intervalo potencial entre os e°s de Ir3+ e Fc (+0.25 V ∼ +0.55 V).

em seguida, comparamos os filmes de controle chitosano e feomelanin-chitosano usando o par mediador Fc-Ru3+. A figura 4c mostra pequenas amplificações nas correntes redutoras na região a (Ru3+) e correntes de oxidação na região B (Fc). A amplificação emparelhada das correntes de oxidação e redução fornece evidências de que a feomelanina sintética pode ter atividade redox adicional entre -0,2 V e +0,25 V. Para o caso da eumelanina, Fig. 4d mostra substancial emparelhado amplificações (Ru3+ redução na região e Fc oxidação na região B), confirmando que eumelanin é redox-ativos e com um potencial redox entre -0.2 V e +0.25 V.

Finalmente, comparamos o controle de quitosana e a melanina-quitosana filmes usando o Ir3+ -Ru3+ mediador par que abrange a maior gama de potenciais redox (entre -0.2 V e +0.55 V). Como indicado na parte inferior da Fig. 4e, f, o amplo intervalo redox que está sendo sondado pelo par mediador Ir3+ -Ru3+ abrange as janelas redox mais estreitas nas quais a atividade redox foi observada para a feomelanina (Fig. 4a) e eumelanina (Fig. 4d). Porque Fc foi excluído desta mistura mediadora, Fig. 4e, f mostram que não são observados Picos na região B (oxidação Fc) ou na região D (redução Fc). No entanto, tanto as amostras de feomelanina como de eumelanina mostraram fortes amplificações emparelhadas em grande região potencial, o que corrobora ainda mais a conclusão de que ambas as melaninas sintéticas têm atividade redox.

reversibilidade da actividade Redox oxidativa específica da feomelanina

focámo-nos em seguida na região potencial oxidativo para fornecer mais provas da actividade redox da feomelanina. Experimentalmente, mergulhámos eléctrodos revestidos de melanina-quitosano em soluções que continham os três mediadores e impusemos a potencial entrada ilustrada na Fig. 5a. o “pré-tratamento” inicial (-0,4 V vs Ag / AgCl durante 5 minutos) envolve o mediador Ru3+ no seu ciclo redutor redox para transferir electrões do eléctrodo para a amostra de melanina (isto é, para reduzir algumas das moléculas activas redox). Em seguida, sondamos a amostra através de ciclagem repetida do potencial entre -0,1 V e + 0,8 V, o que impede o mediador Ru3+ de continuar a participar nas reações redox (ou seja, o mediador Ru3+ permanece “silencioso” durante esta fase de sondagem).

a figura 5b mostra a resposta actual do eléctrodo revestido de feomelanina-quitosano ao potencial Cíclico imposto apresentado como um voltammagrama Cíclico padrão (CV), enquanto Fig. 5c mostra os resultados como uma curva de saída (para maior clareza, os resultados para a película de quitosano de controle são mostrados apenas na Fig. 5c). Há duas observações importantes destas parcelas. Em primeiro lugar, a amplificação da Ir3+ -oxidação (região C) é emparelhada com uma amplificação da redução Fc (região D). Em segundo lugar, ambas as amplificações parecem quase “estáveis” ao longo do tempo: especificamente, as curvas CV da Fig. 5b são aproximadamente superimposíveis e as curvas de saída da Fig. 5c parecem ser semelhantes para cada ciclo consecutivo (Nota:: A figura S4 das informações suplementares mostra que a saída não é exatamente estável, mas sim uma pequena transferência líquida de carga oxidativa durante cada ciclo). Esta quase constante de amplificação demonstra o pheomelanin do oxidativo redox atividade envolve metades que pode ser repetidamente oxidada e reduzida.

os resultados com feomelanina sintética podem ser contrastados com os da eumelanina sintética observados na Fig. 5d, E. Especificamente, a corrente de oxidação amplificada não é emparelhada com uma corrente de redução amplificada indicando uma depleção líquida de elétrons da amostra de melanina. Consistente com esta explicação é a observação de que o resultado da eumelanina não é estável: as curvas CV não sobrepõem (Fig. 5d) e as correntes de oxidação de pico são atenuadas por cada ciclo consecutivo (Fig. 5e). Estas observações indicam que os electrões inicialmente transferidos para a amostra de eumelanina pelo pré-tratamento Ru3+ estão a ser esgotados durante cada etapa de oxidação Ir3+.

Análise Dinâmica: Variando a frequência de entrada

a análise dinâmica é rotineiramente usada para engenharia reversa de sistemas tecnológicos. A figura 6a ilustra que sondámos dinamicamente as amostras de melanina encravadas por película variando a frequência da entrada potencial oscilante imposta (gama de potencial de -0,5 V a +0,8 V; gama de frequência de varrimento de 2 a 1000 mV/S) na presença dos três mediadores (Ir3+, Fc e Ru3+). Como ilustrado na Fig. 6a, a frequência de entrada controla a profundidade da região do filme sondada pelo redox-ciclismo dos mediadores. Para análise, Fig. 6b mostra que nos concentramos nos sinais associados à redução Fc (região D) e oxidação Fc (região B) e usamos duas razões de correntes de pico para correlacionar os resultados. A primeira razão, a razão de amplificação (AR), compara a resposta dos filmes contendo melanina à resposta do filme quitosano. Como esperado, Fig. 6c mostra que esta razão de amplificação é maior em taxas de varredura mais baixas, enquanto esta proporção se aproxima de 1 em altas taxas de varredura (ou seja, os filmes contendo amostras e controlar o filme quitosano se comportam da mesma forma).

o segundo rácio é uma medida operacional de rectificação. A figura 6d mostra que em altas frequências, a RRFc para as duas amostras de melanina e o quitosano controlam todas as aproximações 1. Em baixas frequências, Fig. 6D mostra RR > 1 para a feomelanina, mas rr < 1 para a eumelanina, o que é consistente com observações anteriores. Mais especificamente, a feomelanina envolve o Fc no ciclismo redox com o Fc servindo como redutor (região D), enquanto que a eumelanina envolve o Fc no ciclismo redox com o Fc servindo como oxidante (região B).

análise dinâmica: impondo entradas em degrau

um teste electroquímico final foi realizado usando uma sequência de alterações potenciais em degrau na presença de todos os três mediadores. A figura 7a mostra uma tensão inicial de -0,4 V foi usada para iniciar o ciclo Ru3 + redox para transferir elétrons para reduzir a amostra de melanina entrapada. O primeiro passo muda de -0,4 para +0.8 V permite que Fc e Ir3+ sejam oxidados e iniciem o ciclo oxidativo redox para transportar elétrons da melanina entrapada para o eletrodo. Como indicado na Fig. 7a, este potencial foi mantido durante 5 minutos durante o qual a transferência de electrões foi medida como demonstrado na Fig. 7b.a transferência cumulativa de carga (após 5 minutos) para o filme quitosano de controlo foi atribuída à simples difusão dos mediadores através do filme e este valor foi subtraído da transferência cumulativa de carga medida para os filmes que contêm a amostra de melanina. Esta diferença (QFilm) foi atribuída ao ciclo redox no filme e serve como uma medida do número de elétrons transferidos da melanina. Em princípio, esta metodologia poderia ser utilizada para determinar a capacidade total de redox da amostra de melanina, no entanto um período de 5 minutos é insuficiente para transferir exaustivamente elétrons de amostras de partículas (por exemplo, seriam necessárias várias horas)45. Assim, a nossa capacidade redox calculada (nfilm; nmole electron/cm2) é uma medida Operacional útil para comparação semi-quantitativa.

a figura 7a mostra que após o passo de oxidação inicial, um passo de redução foi imposto de + 0,8 para -0,4 V. Este passo permite que um ciclo Ru3+ redox reduza a melanina através da obturação de elétrons do eletrodo para a melanina. Este passo potencial também permite que Fc+ redutivamente-redox ciclo com feomelanina. A figura 7c mostra os resultados desta etapa de redução e indica que a transferência de carga para ambas as amostras de melanina é maior do que a transferência de carga observada com a película de controlo. The ability of these samples to both doate electrons(Fig. 7b) e aceitam electrões (Fig. 7c) apoia a conclusão de que ambas as amostras de melanina sintética são redox ativas.

a figura 7d resume os resultados destas experiências. As entradas na Fig. 7d são para os experimentos de oxidação de Figo. 7B and reduction experiments of Fig. 7c, respectivamente. As diferenças quantitativas nos valores de NFilm entre estas condições reflectem presumivelmente diferenças cinéticas. Por exemplo, a força motriz para eumelanin de oxidação (por ambos os Ir3+ e Fc) é consideravelmente maior do que a força motriz para eumelanin redução (por Ru3+) e isso talvez explique o eumelanin maior NFilm na etapa de oxidação (65 nmole/cm2), em comparação com a sua etapa de redução (12 nmole/cm2). Argumentos semelhantes podem explicar as diferenças observadas entre a redução da eumelanina e da feomelanina na segunda entrada da Fig. 7d: a força motriz para a redução da feomelanina (por Ru3+ e Fc+) é maior do que para a redução da eumelanina (por Ru3+).

avaliação de amostras de melanina Natural

avaliámos em seguida amostras de eumelanina natural e de feomelanina para fornecer provas das duas principais observações de estudos com os modelos sintéticos: (i) a melanina é redox activa; e (ii) A feomelanina tem uma maior actividade pró-oxidante à base de redox. Nestes estudos, preparámos filmes de melanina-quitosano com um teor de melanina de 248 µg/mL e 484 µg / mL para eumelanina natural e feomelanina, respectivamente. Imergimos o eléctrodo revestido por película numa solução contendo os três mediadores redox (100 µM Ir3+, 50 µM Fc e 50 µM Ru3+) e aplicámos diferentes entradas potenciais. No primeiro estudo, foi imposta uma entrada de potencial Cíclico (- 0, 5 a +0, 8 V vs Ag/AgCl; taxa de varrimento de 2 mV/S) e Fig. 8 mostra amplificações significativas nas correntes de oxidação e redução para ambas as amostras eumelanina e feomelanina. A amplificação emparelhada das correntes de oxidação e redução suporta a primeira conclusão de que ambas as melaninas naturais são redox-ativas e podem ser trocadas entre Estados reduzidos e oxidados.

curiosamente, a assinatura característica da feomelanina sintética – amplificação na região D observada na Fig. 3 – não é aparente com a amostra natural de feomelanina. Possivelmente, uma atenuação deste pico característico D pode refletir a natureza polimérica mista das melaninas naturais. Uma abordagem experimental para acomodar esta natureza polimérica mista é comparar o comportamento de amostras de melanina natural com uma mistura de melaninas sintéticas 46, 47, 48. Para o nosso estudo, preparámos filmes contendo misturas de eumelanina sintética e feomelanina e analisámos estes filmes utilizando três entradas potenciais diferentes, como ilustrado pelos painéis superiores da Fig. 9 (ver Figura S5 das informações suplementares para mais pormenores). Como indicado pelos painéis do meio em Fig. 9, as saídas foram analisadas integrando as correntes para determinar a carga total transferida durante a redução (QRed) e oxidação (QOx) e, em seguida, criando uma razão de redução para oxidação (razão Redox). A expectativa é que uma amostra com maior atividade pró-oxidante baseada no redox teria uma maior razão Redox, pois iria atrair mais elétrons do eletrodo.

no primeiro teste, realizamos voltametria cíclica (por exemplo, como na Figo. 8) e analisaram os resultados como ilustrado pelo painel superior em Fig. 9a. Para as misturas de melanina sintética, os resultados no painel inferior de Figo. 9A mostram um aumento linear na razão Redox com a fracção de feomelanina sintética. Esta tendência observada deve-se à maior actividade pró-oxidante da feomelanina sintética. Sobreposto na parcela linear em Fig. 9a são linhas horizontais para os resultados das amostras de melanina natural que mostram que a razão Redox para a feomelanina é superior à da eumelanina. Curiosamente, o ponto de intersecção da linha horizontal para pheomelanin com os resultados das misturas sintéticas, sugere que o conteúdo de eumelanin natural pheomelanin exemplo, é de aproximadamente 40%, o que está de acordo com a análise química de vermelho humanos hair39.

no segundo ensaio, O painel superior na Fig. 9b mostra que impusemos entradas em potencial para cada um dos eletrodos revestidos por película de melanina por 5 minutos e medimos a transferência de carga tanto para a mudança de passo para as condições de redução e para as condições de oxidação(análoga aos experimentos na Fig. 7). A trama em Fig. 9b mostra novamente que, para as misturas de melanina sintética, a razão Redox aumentou linearmente com a fração de feomelanina sintética. Os resultados para as melaninas naturais (linhas horizontais) mostram novamente a razão Redox para a feomelanina é maior do que para a eumelanina.

o ensaio final foi realizado por meio de um ciclo de 10 vezes o potencial entre -0,1 V e 0,8 V para sondar a gama de potencial redox mais oxidativo(análogo a experiências na Fig. 5). Como indicado pelo painel do meio na Fig. 9c, calculámos a carga transferida dos últimos três ciclos e calculámos a razão Redox. Consistente com os dois testes anteriores, a razão Redox aumentou linearmente com a fração de feomelanina sintética no filme e a feomelanina natural teve uma maior razão Redox do que a eumelanina natural.

em conclusão, os resultados para as melaninas naturais são qualitativamente consistentes com os dos modelos sintéticos: as melaninas são redox-activas e a feomelanina tem uma maior actividade pró-oxidante à base de redox.