Introduzione
Le cellule gangliari retiniche (RGCS) trasmettono informazioni visive dall’occhio al cervello attraverso i loro assoni, che formano collettivamente il nervo ottico (Laha et al., 2017). Le lesioni del nervo ottico indotte da traumi, glaucoma o malattie neurodegenerative spesso provocano la perdita delle funzioni visive e alla fine la cecità. Le strategie che promuovono la sopravvivenza RGC e la rigenerazione del nervo ottico sono attivamente perseguite per riparare le lesioni neurali e ripristinare la funzione visiva. Come neuroni del sistema nervoso centrale (SNC), gli RGC maturi hanno notevolmente ridotto la capacità intrinseca di rigenerare i loro assoni dopo lesioni traumatiche o neurodegenerazione, portando alla perdita della vista (Chun e Cestari, 2017; Laha et al., 2017). Inoltre, contrariamente ai neuroni nel sistema nervoso periferico (PNS), varie molecole inibitorie estrinseche agiscono per limitare la rigenerazione degli assoni nel SNC, incluso il midollo spinale e i nervi ottici (Geoffroy e Zheng, 2014). Studi precedenti hanno dimostrato che la rimozione di fattori inibitori extracellulari, come Nogo e i suoi recettori, potrebbe indurre una lieve rigenerazione del nervo ottico (Fischer et al., 2004; Su et al., 2008, 2009; Dickendesher et al., 2012). Al contrario, l’eliminazione di fosfatasi e tensin homolog (Pten) in RGCS, che ha potenziato la capacità intrinseca di rigenerazione degli assoni, ha promosso una robusta rigenerazione del nervo ottico, indicando nuove promettenti strade per migliorare la rigenerazione degli assoni del SNC (Park et al., 2008). Negli ultimi dieci anni, la manipolazione di diversi geni in RGCS ha dimostrato di aumentare significativamente la capacità intrinseca di rigenerazione degli assoni di RGCS maturi, come Klf4/9 (Moore et al., 2009; Apara et al., 2017), Socs3 (Smith et al., 2009), B-RAF (O’Donovan et al., 2014), c-myc (Belin et al., 2015), GSK3ß (Guo et al., 2016; Miao et al., 2016), Lin28 (Wang et al., 2018), e P53 (Ma et al., 2019). Sebbene questi geni abbiano dimostrato di regolare la rigenerazione del nervo ottico, quasi nessuno di essi da solo potrebbe essere manipolato per indurre la ricrescita degli assoni a lunga distanza in vivo. Per risolvere questo problema, sono state tentate strategie combinatorie per estendere le lunghezze degli assoni rigenerativi. In effetti, gli effetti sinergici o additivi di più percorsi indipendenti sulla rigenerazione degli assoni RGC erano più drammatici e sostenibili, come la delezione di Zymosan/cAMP/Pten (Kurimoto et al., 2010), CNTF / Pten-deletion / Socs3-deletion (Sun et al., 2011), c-Myc/CNTF/Pten-deletion/Socs3-deletion (Belin et al., 2015), e Lin28/Pten-deletion (Wang et al., 2018). In alcuni studi, è stato riferito che la rigenerazione degli assoni RGC potrebbe raggiungere lunghe distanze, attraversando il chiasma ottico ed entrando nel cervello (Kurimoto et al., 2010; Sun et al., 2011; de Lima et al., 2012; Lim et al., 2016).
Il passo successivo dopo la rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza dovrebbe essere esplorare come la funzione visiva potrebbe essere ripristinata con una corretta guida degli assoni, sinaptogenesi e trasmissione dell’attività neurale. Ad oggi, la rigenerazione del nervo ottico de novo attraverso il chiasma sembra essere il collo di bottiglia per rigenerare gli assoni RGC per entrare nel cervello. Pertanto, solo pochi studi che utilizzano approcci combinatori hanno riportato una riconnessione molto limitata tra gli assoni del nervo ottico feriti e i loro bersagli nel cervello, come il nucleo suprachiasmatico (SCN), il nucleo genicolato laterale (LGN), il collicolo superiore (SC) e altre aree visive con un periodo più lungo dopo la lesione (de Lima et al., 2012; Bei et al., 2016; Lim et al., 2016) o eseguendo l’infortunio al pre-chiasma (Li et al., 2015) o tratto ottico (Bei et al., 2016). Sebbene sia ancora necessaria un’ulteriore conferma di questi studi, i risultati hanno fornito alcune prove in linea di principio che il recupero della funzione visiva è possibile dopo la lesione del nervo ottico se è possibile ottenere ogni fase della ricrescita degli assoni, della guida, della sinaptogenesi e della remielinazione. Qui, esaminiamo i recenti progressi nel raggiungimento della riconnessione dei percorsi occhio-cervello e discutiamo potenziali strategie future per ricablare i circuiti visivi dopo le lesioni del nervo ottico.
La rigenerazione degli assoni a lunga distanza può essere ottenuta tramite manipolazione combinatoria di più geni/percorsi
Per ripristinare la visione dopo la lesione del nervo ottico, gli assoni feriti devono rigenerare l’intera lunghezza dei percorsi occhio-cervello, una distanza di oltre 8 mm dal sito della lesione a LGN e SC nei topi (Figura 1). La rigenerazione degli assoni a lunga distanza, come primo passo della riconnessione occhio-cervello, è cruciale nel ripristino della funzione visiva dopo la lesione del nervo ottico. Ad oggi, l’eliminazione condizionale di Pten da sola in RGCS ha portato probabilmente alla rigenerazione del nervo ottico più lunga a 2 settimane dopo l’infortunio (fino a 3 mm distale rispetto al sito della lesione; Park et al., 2008). Le manipolazioni di altri geni, elencate nella Tabella 1, hanno dimostrato di promuovere una modesta rigenerazione degli assoni RGC che raggiungono la regione media del nervo ottico dopo la lesione (Tabella 1). Oltre alla manipolazione dell’espressione genica in RGCS, il rilascio non mediato da RGC di CNTF (Leaver et al., 2006), oncomodulina in risposta all’infiammazione (Yin et al., 2006), o potenziamento IGF1 Lin28-mediato amacrina-specifico (Zhang et al., 2019), hanno tutti dimostrato di stimolare la rigenerazione del nervo ottico, da solo o insieme ad altri fattori. Inoltre, un livello elevato di zinco nelle cellule amacrine su lesione del nervo ottico ha dimostrato di contribuire alla morte cellulare RGC e alla rigenerazione fallita trasferendosi lentamente in RGCs (Li et al., 2017). Di conseguenza, il trasportatore dello zinco ZnT-3 (codificato dal gene slc30a3) knockout ha migliorato la sopravvivenza e la rigenerazione di RGC. Inoltre, un aumento del livello di cAMP ha dimostrato di migliorare la rigenerazione del nervo ottico indotta da oncomodulina (Kurimoto et al., 2010). Infine, un sottotipo di RGCS ha dimostrato di produrre una glicoproteina fosforilata secreta, osteopontin (OPN), che agisce insieme a IGF1 o BDNF, per migliorare la rigenerazione del nervo ottico (Duan et al., 2015).
Figura 1. La capacità di promozione dei trattamenti noti sulla rigenerazione del nervo ottico in vivo. Per riconquistare la funzione visiva, la rigenerazione del nervo ottico assoni bisogno di attraversare il chiasma ottico (BUE) e raggiungere determinati nuclei del cervello, tra cui il nucleo soprachiasmatico (SCN), mediale del nucleo terminale (MTN), talamo ventrale o dorsale nucleo genicolato laterale (vLGN, dLGN), opuscolo intergeniculate (IGL), il nucleo del tratto ottico (e NON), olivary pretectal nucleo (OPN), e collicolo superiore (SC). Manipolazione di un singolo fattore, come Pten knockout (PTEN KO), IL6 espressione, o Sox11 sovraespressione (SOX11 OE), è improbabile che migliorare la rigenerazione del nervo ottico per raggiungere il BUE. Tuttavia, gli approcci combinatoriali con più fattori possono indurre la rigenerazione degli assoni a distanza più lunga per raggiungere e attraversare il BUE. In alcuni casi, è stato riportato che una combinazione di più fattori, come Pten/Socs3 co-delezione, infiammazione/cAMP/Pten knockout, o Rheb1 sovraespressione/stimolazione visiva, potrebbe migliorare la rigenerazione del nervo ottico per riconnettersi con i nuclei cerebrali selezionati.
Tabella 1. Manipolazione genetica per promuovere la rigenerazione del nervo ottico nei topi.
Sebbene diversi approcci abbiano dimostrato di promuovere una rigenerazione sostanziale in vivo, la ricrescita di un numero sufficiente di assoni attraverso l’intero percorso ottico rimane una sfida importante. Pertanto, i recenti progressi nella rigenerazione degli assoni RGC non solo si sono concentrati sull’identificazione di nuovi geni e percorsi, ma hanno anche rivelato che i trattamenti combinatori con meccanismi sottostanti distinti hanno prodotto effetti additivi o addirittura sinergici (Tabella 2). Fino ad oggi, la delezione Pten, insieme alla manipolazione di altri geni RGC o fattori extracellulari, è stata la strategia combinatoria dominante per promuovere la rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza. Ad esempio, la cancellazione Socs3 (Sun et al., 2011), Attivazione di B-RAF (O’Donovan et al., 2014), sovraespressione c-Myc (Belin et al., 2015), sovraespressione DCLK2 (Nawabi et al., 2015), espressione hIL-6 (Leibinger et al., 2016), attivazione STAT3 / MEK (Luo et al., 2016), chelazione dello zinco (Li et al., 2017), o iperespressione Lin28 (Wang et al., 2018), ciascuno ha dimostrato di avere effetti sinergici / additivi con delezione Pten sulla rigenerazione del nervo ottico. Inoltre, i fattori extracellulari sopra descritti sono stati tutti combinati con la manipolazione genetica di RGCS, come cAMP/oncomodulina/Pten-delezione (Kurimoto et al., 2010), CNTF / Pten-deletion / Socs3-deletion (Sun et al., 2011). Inoltre, sono stati mostrati anche gli effetti additivi o sinergici di altre strategie combinatorie, come il knockdown Klf9 combinato con la chelazione dello zinco (Trakhtenberg et al., 2018) e CRMP2 costitutivamente attivo combinato con attività GSK3 migliorata (Leibinger et al., 2017). Si ritiene che tali effetti combinatori siano dovuti a diverse vie di segnalazione a valle di questi geni e fattori. Sulla base di studi precedenti, è stato dimostrato che diverse vie di segnalazione svolgono un ruolo importante nella trasduzione degli effetti di promozione di questi geni/fattori. Ad esempio, la segnalazione GSK3/mTOR correlata al fattore di crescita viene attivata a valle della delezione Pten (Park et al., 2008; Leibinger et al., 2019), osteopontin (Duan et al., 2015), melanopsina (Li et al., 2016), Akt (Guo et al., 2016; Miao et al., 2016), o Lin28 (Wang et al., 2018). Inoltre, il percorso MAPK a valle di B-RAF (O’Donovan et al., 2014) o MEK (Luo et al., 2016) è stato coinvolto. Inoltre, la segnalazione di citochine Jak-Stat potrebbe essere attivata a valle del CNTF (Müller et al., 2007), cancellazione Socs3 (Smith et al., 2009), o cancellazione Klf4 (Qin et al., 2013). Inoltre, studi recenti hanno rivelato diverse nuove vie di segnalazione funzionanti per promuovere la rigenerazione del nervo ottico, come la fosfatasi dell’acido fosfatidico (PAP) Lipin1 che ha indotto la rigenerazione attraverso la regolazione del metabolismo dei glicerolipidi (Yang et al., 2020), trombospondina-1 che si legava a syndecan per promuovere la rigenerazione del nervo ottico (Bray et al., 2019), e la proteina LIM muscolare cross-linker di actina (Levin et al., 2019). Vale la pena notare che molti geni regolatori di rigenerazione del nervo ottico possono regolare simultaneamente più percorsi a valle e le vie di segnalazione a valle hanno anche dimostrato di diafonia tra loro.
Tabella 2. Rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza nei topi.
Collettivamente, è ben riconosciuto che la combinazione di molecole con diversi percorsi a valle comporterebbe una rigenerazione degli assoni a distanza più lunga. Pertanto, identificare nuovi fattori con nuovi percorsi di segnalazione, in particolare fattori che possono regolare più percorsi, dovrebbe essere ancora una delle aree focalizzate sul campo. Inoltre, esplorare la combinazione ottimale di più fattori in base ai loro meccanismi normativi è anche molto importante. Infine, va notato che la maggior parte (>80%) di RGCS muore poche settimane dopo la lesione del nervo ottico (Wang et al., 2018; Tran et al., 2019), rendendo la sopravvivenza RGC un ostacolo importante per un numero sufficiente di assoni rigeneranti necessari per il recupero della funzione visiva. Curiosamente, diversi sottotipi di RGCS hanno dimostrato di differire nella loro capacità di sopravvivere o rigenerare gli assoni in seguito a lesioni del nervo ottico (Duan et al., 2015; Norsworthy et al., 2017; Bray et al., 2019). Recentemente, uno studio sistematico utilizzando RNA-seq a cellule singole ha rivelato la vulnerabilità selettiva dei sottotipi RGC a seguito di lesioni assonali e ha fornito prove che le strategie neuroprotettive specifiche del tipo potrebbero essere critiche per l’intervento (Tran et al., 2019). Pertanto, i geni / percorsi che agiscono per proteggere RGCS o sottotipi dalla morte cellulare sono ugualmente importanti da identificare.
Guida corretta degli assoni rigeneranti che passano il Chiasma ottico ed entrano nel cervello
Sebbene gli approcci combinatori dopo la lesione del nervo ottico possano provocare una sostanziale rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza, il chiasma ottico sta emergendo come il principale ostacolo per la rigenerazione degli assoni per entrare nel cervello e raggiungere i loro nuclei Analizzando la rigenerazione degli assoni in momenti successivi dopo la lesione del nervo (cioè 4-10 settimane), in diversi studi utilizzando approcci combinatori, gli assoni rigeneranti potrebbero raggiungere e persino attraversare il chiasma ottico. Ad esempio, quando Pten/Socs3 double knockout è stato combinato con CNTF, 4 settimane (Sun et al., 2011) o 10 settimane (Luo et al., 2013) dopo la lesione del nervo molti assoni rigeneranti potrebbero raggiungere l’estremità prossimale del chiasma ma hanno smesso di crescere. Quando l’espressione c-Myc è stata aggiunta nella combinazione, più assoni hanno attraversato il chiasma e sono cresciuti nei tratti ottici (Belin et al., 2015). Allo stesso modo, altri approcci combinatori, come cAMP/Zymosan/Pten-delezione (de Lima et al., 2012; Luo et al., 2013), Lipin1-delezione / CNTF (Yang et al., 2020), e Pten-deletion/MEK/STAT3 (Luo et al., 2016), potrebbe anche indurre la rigenerazione del nervo ottico vicino o attraversare il chiasma ottico.
Un’osservazione interessante da alcuni di questi studi è stata che molti assoni rigeneranti sono stati rivolti indietro al chiasma o deragliati dal tratto ottico dopo aver attraversato il chiasma. Questa osservazione suggerisce che il chiasma ottico presenta un confine inibitorio e la cattiva guida degli assoni si verifica nel tratto ottico. Infatti, come già detto, l’eliminazione di Nogo e dei suoi recettori nel sistema visivo ha provocato una lieve rigenerazione del nervo ottico, indicando la natura inibitoria del sistema visivo maturo. In uno studio iniziale (Pernet et al., 2013a), utilizzando l’approccio di compensazione del tessuto e l’imaging confocale dell’intero nervo ottico di mount, lo studio ha rilevato che molti assoni rigeneranti indotti da CNTF hanno mostrato traiettorie irregolari, con molte curve a U all’interno del nervo ottico. In uno studio successivo dello stesso laboratorio (Pernet et al., 2013b), la rigenerazione degli assoni RGC indotti da STAT3 attivo ha anche mostrato traiettorie erranti con frequenti inversioni a U. Tuttavia, quando i nervi ottici sono stati ulteriormente trattati con l’inibitore della Rho chinasi Y27632, gli assoni rigeneranti indotti da Stat3 sono diventati più diritti e l’U-rate è stato marcatamente ridotto. Poiché l’inibitore della Rho chinasi è ben noto per antagonizzare gli effetti inibitori dell’inibitore a base di mielina (cioè, Nogo, MAG), questi risultati hanno confermato la presenza di molecole inibitorie extracellulari nel nervo ottico. A sostegno, utilizzando la pulizia del tessuto e la microscopia a fluorescenza a foglio leggero avanzata (LSFM), tre studi (Luo et al., 2013; Yungher et al., 2015; Bray et al., 2017) ha eseguito immagini 3D ad alta risoluzione e analisi morfologiche assonali dettagliate a livello di singolo assone. In particolare, i risultati hanno scoperto che all’interno del nervo ottico la maggior parte degli assoni rigeneranti aveva un percorso tortuoso e molti di loro facevano curve strette. Per gli assoni che raggiungono il chiasma, alcuni assoni tornarono al chiasma e entrarono nel nervo ottico non ferito opposto, confermando il chiasma come barriera inibitoria. Per gli assoni che sono riusciti ad attraversare il chiasma, sono stati osservati più assoni nel tratto ottico ipsilaterale che nel tratto controlaterale, indicando una cattiva guida degli assoni. Alcuni assoni sono stati identificati nel SCN situato direttamente sopra il chiasma e nessun assone è stato osservato nei bersagli visivi più distanti, LGN o SC. Coerentemente con questi risultati, il nostro recente studio che utilizza la clearing dei tessuti e l’imaging 3D (Wang et al., 2018) ha dimostrato che gli assoni RGC rigeneranti indotti da sovraespressione Lin28 hanno anche mostrato molte svolte a U all’interno del nervo ottico, che è stato ridotto quando l’espressione Lin28 è stata combinata con l’abbattimento Pten. Inoltre, il nostro ultimo studio (Wang et al., 2020) ha dimostrato che l’eliminazione della miosina IIA/B nei soli RGCS ha comportato una significativa rigenerazione del nervo ottico. È interessante notare che, quando le traiettorie degli assoni sono state esaminate con clearing del tessuto e imaging 3D, nei topi wild type gli assoni corti rigenerati automaticamente seguivano traiettorie erranti con molte curve a U, mentre nei topi knockout di miosina IIA/B gli assoni rigeneranti erano molto più dritti con curve a U notevolmente ridotte. Ancora più importante, la combinazione di iperespressione Lin28 con miosina IIA / B knockout ha portato alla rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza in 2 settimane dopo la lesione del nervo (fino a 4,5 mm dal sito della lesione). Perché il nostro studio precedente (Hur et al., 2011) ha dimostrato che l’eliminazione della miosina IIA/B ha permesso la crescita dell’assone su due principali substrati inibitori, detriti di mielina e CSPGs, i nuovi risultati hanno fornito la prova che il superamento dei segnali inibitori nel nervo ottico era un approccio promettente per una rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza più efficiente.
Infine, per esaminare meglio come si comportavano gli assoni rigeneranti al chiasma ottico, uno studio (Li et al., 2015) ha usato un modello di lesione pre-chiasm, in cui gli assoni rigeneranti dovevano solo crescere a breve distanza per raggiungere il chiasm. Lo studio ha dimostrato che a 4 settimane dopo la lesione del nervo, molti assoni entrarono e passarono il chiasma, la maggior parte dei quali occupava il lato ipsilaterale dell’ipotalamo, incluso il SCN. A 8 settimane, sono stati trovati più assoni all’interno della SCN. Una scoperta importante è stata che anche a 4 mesi dopo la lesione del nervo, quasi nessun assone rigenerante ha raggiunto obiettivi cerebrali più lontani dal chiasma ottico, come l’OPN e lo SC. Questo studio ha inoltre confermato che senza adeguati segnali di guida, è difficile per gli assoni rigeneranti reinnervare bersagli cerebrali più profondi.
In sintesi, questi studi hanno suggerito che adeguati meccanismi di guida degli assoni sono necessari per rigenerare gli assoni RGC per raggiungere i loro nuclei mirati originali nel cervello e il successivo recupero funzionale visivo. Nuove tecniche sperimentali, come approcci di clearing del tessuto (3DISCO, CLARITY, ecc.) e sistemi di imaging 3D avanzati (microscopia multifotonica, LSFM, fMOST, ecc.), stanno emergendo per essere strumenti utili per l’analisi dettagliata della traiettoria degli assoni nel cervello.
Rigenerazione degli assoni dall’occhio al cervello Salvataggio di comportamenti visivi parziali
Dopo che gli assoni rigeneranti raggiungono i loro obiettivi cerebrali originali, la prossima sfida è raggiungere una nuova sinaptogenesi, la remielinizzazione e il successivo ripristino funzionale della visione. Ad oggi, solo pochi studi hanno riportato la riconnessione funzionale con i nuclei cerebrali dopo la schiacciamento del nervo ottico. Uno studio iniziale ha dimostrato che la combinazione di delezione Pten con Zymosan e cAMP ha portato alla rigenerazione degli assoni a lunga distanza che attraversano il chiasma ottico e nelle strutture cerebrali, tra cui SCN, dLGN e SC, 10 settimane dopo la lesione del nervo ottico. L’evidenza istologica ha dimostrato che i terminali degli assoni rigeneranti sembravano formare sinapsi all’interno dei nuclei mirati. Di conseguenza, diversi comportamenti visivi innati sono stati parzialmente ripristinati, come la percezione della profondità, la risposta optomotoria e i modelli di attività circadiana (de Lima et al., 2012). In uno studio successivo in cui è stato utilizzato lo stesso approccio combinatorio (Luo et al., 2013), la clearing del tessuto a monte intero e l’analisi di imaging 3D con LSFM hanno mostrato che gli assoni rigeneranti sono stati effettivamente osservati dentro e oltre il chiasma ottico. Tuttavia, in contrasto con lo studio di cui sopra (de Lima et al., 2012), sono stati osservati solo alcuni assoni che raggiungono la SCN e non sono stati trovati assoni rigeneranti oltre la SCN. Molti assoni sono stati osservati in luoghi che non erano associati alla via ottica, indicando la cattiva guida degli assoni. Nello stesso studio, Socs3 / Pten double knockout, insieme a CNTF, sono stati utilizzati per indurre la rigenerazione degli assoni a lunga distanza. Allo stesso modo, gli assoni rigeneranti potevano raggiungere e attraversare il chiasma ottico e nessun assone poteva essere trovato oltre il SCN. Per escludere la possibilità che la procedura di pulizia del tessuto possa sbiancare il segnale tracciante CTB, sono state esaminate sezioni cerebrali coronali regolari. Allo stesso modo, gli assoni rigeneranti marcati CTB sono stati trovati principalmente nell’area dell’ipotalamo, incluso il SCN, e nessun assone è stato identificato negli obiettivi più distanti, LGN e SC.
In un recente studio, migliorando l’attività neurale RGC e attivando la segnalazione mTOR (sovraespressione Rheb1) la rigenerazione degli assoni a lunga distanza e il corretto pathfinding in tutti i principali obiettivi visivi sono stati osservati già 3 settimane dopo la lesione del nervo ottico (Lim et al., 2016). In particolare, nei topi che ricevono stimolazione visiva e trattamento di sovraespressione Rheb1, le connessioni di nuova formazione potrebbero parzialmente ripristinare la risposta optomotoria mediante analisi riflessa optocinetica( OKR), mentre non sono riusciti a salvare la risposta della pupilla, la percezione della profondità e la risposta alla paura visiva (Lim et al., 2016). Lo studio ha suggerito che tale recupero funzionale parziale potrebbe riflettere difetti nella formazione di sinapsi, un numero insufficiente di assoni rigeneranti e/o una bassa precisione di pathfinding all’interno dell’obiettivo. Insieme, ad oggi, ci sono solo pochissimi studi (de Lima et al., 2012; Lim et al., 2016) ha riportato la rigenerazione del nervo ottico a lunga distanza con parziale recupero della funzione visiva, tra cui uno studio non può essere ripetuto in uno studio diverso (Luo et al., 2013). Pertanto, sono necessari ulteriori studi per confermare se dopo la lesione del nervo ottico intraorbitale gli assoni RGC rigeneranti possono essere correttamente guidati per raggiungere i loro obiettivi innervanti originali nel cervello.
Nonostante i progressi significativi nella promozione degli assoni RGC oltre il chiasma ottico nel cervello dopo la lesione del nervo ottico, è difficile esplorare il percorso degli assoni attraverso il chiasma e la successiva reinnervazione dell’obiettivo a causa del numero limitato di assoni rigeneranti che raggiungono il cervello. Per risolvere un tale problema, come menzionato sopra in uno studio (Li et al., 2015) la lesione del nervo ottico pre-chiasma è stata eseguita in modo che più assoni potessero raggiungere e attraversare il chiasma ottico. In questo studio, le sezioni seriali hanno rivelato che dopo un periodo più lungo si potevano identificare più assoni rigeneranti nella regione centrale di SCN. Concentrandosi sulla SCN, lo studio ha utilizzato anticorpi sia contro il marcatore pre-sinaptico vescicular glutamate transporter 2 (VgluT2) che contro il marcatore di densità postsinaptico Homer1 per etichettare la nuova formazione di sinapsi. Sono stati identificati molti punti a tripla etichetta (CTB, VgluT2, Homer1), che indicano siti sinaptici eccitatori su assoni rigeneranti positivi a CTB rigeneranti. Ulteriori esperimenti utilizzando virus pseudo-rabbia codifica GFP fornito la prova che la rigenerazione degli assoni RGC formata connessioni con i circuiti cerebrali esistenti. Infine, utilizzando la stimolazione del polso leggero dell’occhio ferito, l’espressione genica c-Fos è stata osservata nella SCN dopo il trattamento, indicando sinapsi funzionali riformate nella SCN. Inoltre, le registrazioni di patch-clamp a cellule intere di neuroni SCN con stimolazione del nervo ottico hanno mostrato EPSC evocati, confermando le connessioni sinaptiche eccitatorie riformate. Sulla base della stessa logica, un altro studio recente (Bei et al., 2016) ha adottato un modello di transezione del tratto ottico (prossimale alla SC) che ha notevolmente ridotto la distanza tra gli assoni rigeneranti e la SC. In questo studio, la combinazione di Pten / Socs3 co-delezione con CNTF / BCL2 o co-sovraespressione di OPN / IGF1 / CNTF, ha indotto la rigenerazione dell’assone retinocollicolare e la formazione di sinapsi funzionale dopo la transezione del tratto ottico. Tuttavia, gli assoni rigeneranti mostravano una scarsa conduzione elettrica e quindi non riuscivano a ripristinare una significativa funzione visiva. Una potenziale ragione per il fallimento è probabilmente associata a una mancanza di mielinizzazione. I bloccanti dei canali del potassio voltaggio-dipendenti (4-AP o 4-AP-3-Me) sono stati usati per migliorare la conduzione negli assoni de-mielinizzati di pazienti con sclerosi multipla. Come previsto, l’applicazione acuta di 4-AP ha migliorato significativamente la conduzione elettrica, con conseguente recupero significativo della funzione visiva. Insieme, questi due studi con lesioni assoniche vicino ai loro obiettivi innervanti hanno fornito prove chiave che quando sufficienti assoni rigeneranti potrebbero raggiungere i loro obiettivi cerebrali sono possibili la formazione di sinapsi e il ripristino della funzione visiva.
In sintesi, i dati esistenti fino ad oggi supportano che: (1) con approcci combinatoriali, è possibile indurre la rigenerazione degli assoni a lunga distanza ad entrare nel cervello; e (2) con una corretta guida e remielinazione degli assoni, la funzione visiva potrebbe essere ripristinata (Figura 2). Il percorso eye-to-brain contiene più strutture target, che sono associate a varie funzioni visive correlate, come lo stato fisiologico dell’intero animale, i comportamenti riflessivi visivamente guidati e la codifica di caratteristiche visive complesse(Dhande et al., 2015). Di conseguenza, la soluzione ottimale per il recupero funzionale dopo la lesione del nervo ottico richiede la rigenerazione a lunga distanza dell’assone dal sito di lesione nel cervello, la guida adeguata dell’assone per raggiungere i nuclei centrali specifici, la riforma delle sinapsi funzionali con gli obiettivi appropriati e la remyelination per permettere la trasduzione degli impulsi elettrici.
Figura 2. Ricablaggio funzionale delle connessioni occhio-cervello. Il primo passo di una strategia di riparazione ideale dovrebbe essere la promozione di una sufficiente rigenerazione a lunga distanza degli assoni delle cellule gangliari retiniche danneggiate (RGC) ai loro obiettivi originali. In secondo luogo, gli assoni rigeneranti devono essere adeguatamente guidati attraverso il chiasma ottico (BUE) e raggiungere i loro obiettivi innervanti originali nel cervello, che ciascuno media diverse funzioni visive. In terzo luogo, per il recupero funzionale, gli assoni rigeneranti devono riformare le sinapsi funzionali con gli obiettivi appropriati e rimielinare per la conduzione elettrica. Infine, i circuiti del nervo ottico, che governano lo stato fisiologico dell’intero animale, i comportamenti riflessivi visivamente guidati e le caratteristiche visive complesse, potrebbero essere ristabiliti per ripristinare le funzioni visive.
Prospettive future
Nonostante i significativi progressi nella rigenerazione RGC negli ultimi dieci anni, la riparazione funzionale nel percorso visivo ha ancora molta strada da fare. Sulla base degli studi sopra descritti, una domanda importante è dove dovremmo andare presto. In primo luogo, anche se abbiamo identificato molti geni che possono essere manipolati per migliorare la rigenerazione del nervo ottico, la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari con cui la rigenerazione degli assoni è regolata rimane frammentata. Ad esempio, durante la maturazione neuronale quali sono i passaggi chiave e i regolatori essenziali che gradualmente spengono la capacità di crescita degli assoni? Quali sono le differenze chiave tra i neuroni del SNC che hanno perso quasi permanentemente la loro capacità di supportare la rigenerazione degli assoni, rispetto a quelli del PNS che possono riattivare la loro capacità intrinseca? Di tutti i neuroni nello stesso tessuto, hanno tutti la stessa capacità di supportare la rigenerazione degli assoni? In che modo altre cellule della retina, come le cellule di Müller, le cellule amacrine, contribuiscono alla perdita della capacità di rigenerazione degli assoni dei RGCS durante la maturazione e la rigenerazione fallita dopo gli infortuni? L’approccio multiomico sviluppato di recente, come il sequenziamento di RNA -, ATAC e Hi-C, sia a livello bulk che a livello unicellulare, supportato dalle analisi bioinformatiche avanzate, sarà uno strumento molto utile per affrontare queste domande (Tran et al., 2019). D’altra parte, i sistemi CRISPR/CAS9-dCAS9 aggiornati rapidamente (Liu et al., 2018; Tian et al., 2019) stanno diventando tecniche mature e affidabili, che possono essere utilizzate per lo schermo funzionale ad alto rendimento di nuovi geni che regolano la sopravvivenza e la rigenerazione RGC. L’applicazione di queste nuove tecniche non solo ci aiuterà a chiarire meglio i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione degli assoni, ma ci guiderà anche a scoprire nuovi geni e percorsi che regolano la sopravvivenza e la rigenerazione degli RGC.
In secondo luogo, dopo la rigenerazione degli assoni a lunga distanza, la prossima sfida è guidare gli assoni rigeneranti per raggiungere i loro obiettivi specifici nel cervello, formare sinapsi funzionali, rimielinare gli assoni appropriati e riguadagnare una specifica funzione visiva. Sfortunatamente, la ricerca aggiornata in questo settore rimane molto limitata. Sebbene alcuni studi abbiano dimostrato la rigenerazione a lunga distanza degli assoni del nervo ottico a tutti i nuclei cerebrali e un certo recupero della funzione visiva, sono necessari ulteriori studi per confermare questi risultati. Diversi studi precedenti (Luo et al., 2013; Yungher et al., 2015; Wang et al., 2020) hanno dimostrato chiaramente che l’imaging 3D ad alta risoluzione a livello di singolo assone è un approccio ottimale per seguire le traiettorie degli assoni rigeneranti nel cervello.
In terzo luogo, l’attuale modello animale più utilizzato di lesione visiva è lo schiacciamento del nervo ottico che è chirurgicamente facile e riproducibile. Tuttavia, più malattie clinicamente rilevanti provocano lesioni del nervo ottico, come glaucoma, neurite ottica, neuropatia ottica e atrofia del nervo ottico. Poiché diverse malattie possono indurre diverse risposte cellulari, diversi modelli animali che imitano ogni malattia dovrebbero essere utilizzati prima di una potenziale applicazione traslazionale.
Contributi dell’autore
S-GY, C-ML e F-QZ progettarono, scrissero, revisionarono e finalizzarono il manoscritto. C-PL ha curato il manoscritto. X-QP ha progettato le figure. Z-QT ha fornito commenti costruttivi. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale del manoscritto.
Finanziamento
Per questo lavoro, F-QZ è stato sostenuto da sovvenzioni del NIH (National Eye Institute; Istituto Nazionale di disturbi neurologici e ictus; R01NS085176, R01EY027347, R01EY030883), la Craig H. Neilsen Foundation (259450) e la Birght Focus Foundation (G2017037). C-ML è stato supportato da sovvenzioni del programma di ricerca prioritario strategico dell’Accademia cinese delle Scienze (XDA16010302), del programma nazionale di ricerca e sviluppo del progetto China (2016YFA0101402) e della National Science Foundation of China (91753140). S-GY è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation of China (81370051).
Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.