Reverse Engineering angewendet auf rotes menschliches Haar Phäomelanin zeigt Redox-Pufferung als Pro-Oxidationsmechanismus

Anfängliche Charakterisierung

Synthetische Modelle der Phäomelanin- und Eumelaninpigmente wurden in der vorliegenden Studie zusammen mit natürlichen Melaninproben35 untersucht. Die synthetischen Melanine wurden durch enzymatische Oxidation von Dihydroxyphenylalanin (Dopa) und 5-S-Cysteinyldopa, den wichtigsten biosynthetischen Vorläufern von natürlichem Eumelanin bzw. Natürliche Melaninproben wurden aus menschlichem Haar durch enzymatische proteolytische Verfahren gereinigt9.

Chemische Charakterisierung

Die chemische Charakterisierung der Melanin-Chitosan-Filme erfolgte mittels Raman-Spektroskopie (Abbildung S1 der Zusatzinformation zeigt REM-Bilder für diese Filme). Abbildung 2a zeigt, dass das Spektrum von synthetischem Eumelaninpulver zwei eng beieinander liegende charakteristische Banden hat36. Bande 1 (1360 cm−1) und Bande 2 (1580 cm−1), die auf die lineare Streckung der C-C-Bindungen innerhalb der aromatischen Ringe bzw. die In-Ebene Streckung der aromatischen Ringe zurückgeführt wurden36,37. Diese beiden charakteristischen Banden wurden auch beobachtet, wenn synthetisches Eumelanin im Chitosanfilm eingeschlossen wurde (Chitosan zeigt in diesem Spektralbereich keine Banden).

Die Raman-Charakterisierung des synthetischen Phäomelaninpulvers und des filmeingeschlossenen Phäomelanins ist in Fig. 2b. Im Vergleich zum Spektrum für synthetisches Eumelanin zeigt das Raman−Spektrum für diese Phäomelaninproben zwei zusätzliche markante Peaks oberhalb von 2000 cm-1 (Band 3 und Band 4). Frühere Studien legen nahe, dass diese Bänder mit Oberton- oder Kombinationsbändern verwandt sind38. Diese Raman-Banden wurden auch sowohl für die Pulver- als auch für die filmeingeschlossenen synthetischen Phäomelaninproben beobachtet.

Raman-Spektren natürlicher Melaninproben (Abbildung S2 der Zusatzinformationen) weisen Merkmale auf, die mit denen übereinstimmen, die für synthetische Pigmente beobachtet wurden, obwohl sie aufgrund des Beitrags der Proteinmatrix komplexer sind36,38. Bei natürlichem Phäomelanin lassen sich Eumelanin zurechenbare Banden identifizieren36, was auf das Vorhandensein einer signifikanten Eumelaninkomponente im natürlichen Phäomelanin hindeutet39.

Reverse Engineering von synthetischen Melaninen

Anfängliche Charakterisierung zur Identifizierung der Redoxaktivität

Eine anfängliche elektrochemische Charakterisierung der synthetischen Melanine wurde durchgeführt, indem die filmbeschichteten Elektroden in eine gemischte Lösung von drei Redoxmediatoren (100 µM Ir3 +, 50 µM Fc und 50 µM Ru3 +) getaucht und ein zyklisches Potential an die darunter liegende Elektrode angelegt wurde (zwischen -0.5 V und +0,8 V bei einer Abtastrate von 2 mV/s). Die Mediatorkonzentrationen, die in diesen Studien verwendet wurden, wurden basierend auf anfänglichen Messungen ausgewählt, die dazu dienten, die Bedingungen zu „stimmen“, um nützliche Ausgangssignale zu erhalten. Die Ergebnisse der Chitosan-beschichteten Elektroden mit eingeschlossenem Eumelanin (91 µg / ml) oder Phäomelanin (104 µg / ml) wurden mit einer Chitosan-beschichteten Kontrollelektrode (ohne eingeschlossenes Melanin) verglichen. Das zyklische Voltammogramm (CVs) in Fig. 3a, b zeigt vier Hauptbereiche von Interesse.

Im Bereich „A“ der Fig. 3a, b wurde das Potential in reduzierender Richtung von 0 V auf -0,5 V vs Ag/AgCl überstrichen und die Elektrode fungierte als Elektronenquelle. In diesem Potentialbereich wird der Mediator Ru3+ elektrochemisch zu Ru2+ reduziert, wodurch ein positiver (reduzierender) Strom erzeugt wird. Für die mit Chitosan beschichtete Steuerelektrode wird ein kleiner reduzierender Strom beobachtet, der auf die elektrochemische Reduktion von Ru3 + -Ionen zurückzuführen ist, die durch den Film zur Elektrode diffundieren. Abb. 3a,b zeigt für beide Melaninmodelle eine deutliche Verstärkung der reduzierenden Ströme im Bereich A. Diese Verstärkung wird durch den reduktiven Redox-Cycling-Mechanismus oben rechts in Fig. 1b. Insbesondere diffundiert die elektrochemisch reduzierte Ru2 + -Spezies in den Film und überträgt ihre Elektronen auf das eingeschlossene Melanin, wodurch die oxidierten Melaninanteile in ihre reduzierten Zustände umgewandelt und der oxidierte Ru3 + -Mediator regeneriert werden. Somit zeigt die beobachtete Ausgangsantwort in Region A (verstärkter Ru3 + -Reduktionsstrom) an, dass der Einbau von synthetischem Melanin den Filmen Redoxaktivität verleiht.

In der „B“ -Region wird das Potential durch ein leicht positives Potential gefegt, so dass die Elektrode als Senke für Elektronen dienen kann. Unter dieser Bedingung spendet der oxidierende Mediator Fc Elektronen an die Elektrode, um den negativen (oxidativen) Strom zu erzeugen. Im Vergleich zur Chitosan-Kontrolle wurde die Eumelanin-Chitosan-beschichtete Elektrode (Fig. 3a) zeigt eine erhebliche Verstärkung des Oxidationsstroms im Bereich B, was durch den oxidativen Redox-Cycling-Mechanismus in Fig. 1b. In diesem Fall wird die elektrochemisch oxidierte Fc + -Spezies im Film reduziert, indem Elektronen aus dem eingeschlossenen Eumelanin aufgenommen werden (wodurch reduzierte Eumelanin-Einheiten in ihre oxidierten Zustände umgewandelt werden). Die mit dem Phäomelanin-Chitosan-Film beschichtete Elektrode (Fig. 3b) zeigt in dieser B-Region im Vergleich zur Eumelaninprobe eine geringere Amplifikation.

In der „C“ -Region wird das Potential auf ein höheres positives Potential verschoben, um die Oxidation eines anderen oxidierenden Mediators Ir3+ zu ermöglichen. Unter diesen oxidativeren Bedingungen kann Ir3 + an der Elektrode oxidiert werden, um einen negativen Strom zu erzeugen. Abbildung 3a, b zeigt, dass Oxidationsströme in dieser C-Region sowohl für die Eumelanin- als auch für die Phäomelanin-Filme verstärkt werden. Analog zu den obigen Argumenten für die B-Region resultieren die verstärkten oxidativen Ströme in der Region C aus einem oxidativen Redox-Cycling-Mechanismus, bei dem Ir3 + Elektronen vom eingeschlossenen Melanin zur Elektrode transportiert. Auch hier zeigt die beobachtete Ausgangsreaktion (verstärkte Oxidationsströme in den Regionen B und C), dass Melanin den Filmen Redoxaktivität verleiht.

Im Bereich „D“ wird das Potential in reduzierender Richtung von +0,4 V auf 0 V geschwenkt, wodurch oxidiertes Fc + elektrochemisch zu Fc reduziert werden kann. Abbildung 3b zeigt, dass in der Region D verstärkte Ausgangsströme für das Phäomelanin beobachtet werden, nicht jedoch für die Eumelaninproben (Abb. 3a).

Das erste wichtige Ansprechverhalten, das in Fig. 3 ist die gepaarte Verstärkung von Oxidations- und Reduktionsströmen, die den Nachweis erbringt, dass beide synthetischen Melaninmodelle redoxaktiv sind. Insbesondere sind gepaarte Verstärkungen von Oxidations- und Reduktionsströmen eine charakteristische Signatur des Redoxcycling24 und legen nahe, dass die Melanine sowohl am oxidativen als auch am reduktiven Redoxcycling teilnehmen können, indem sie in einen reduzierten Zustand versetzt werden (indem sie Elektronen von den Mediatoren annehmen; Regionen A oder D) und in einen oxidierten Zustand (durch Abgabe von Elektronen an Mediatoren; Regionen B und C).

Ein zweites wichtiges Ansprechverhalten von Fig. 3 ist, dass die gepaarten Verstärkungen bei unterschiedlichen Potentialen auftreten, was darauf hindeutet, dass das synthetische Eumelanin und Phäomelanin bei unterschiedlichen Potentialen oxidiert / reduziert werden. Die Thermodynamik schränkt Redoxreaktionen so ein, dass Elektronen von Spezies mit negativeren Redoxpotentialen zu Spezies mit positiveren Redoxpotentialen „fließen“. Diese thermodynamische Einschränkung wird zusammen mit den experimentellen Beobachtungen verwendet, um Reduktionspotentiale für Eumelanin abzuschätzen (Abb. 3c) und Phäomelanin (Fig. 3d) und analog zur Abschätzung von Oxidationspotentialen (Fig. 3e, f). Eumelanin weist eine Region verstärkter Reduktion (Region A) und zwei Regionen verstärkter Oxidation (Regionen B und C) auf, was darauf hinweist, dass das Reduktions-Oxidations- (Redox-) Potential des eingeschlossenen Eumelanins am reduzierenden Ende durch das E ° von Ru3 + (-0,2 V vs Ag / AgCl) und am oxidierenden Ende durch das E ° von Fc (+ 0,25 V) eingeklammert ist. Die ausgeprägte Ausgangsantwort der filmeingeschlossenen Phäomelaninprobe (Amplifikation der Region D) zeigt an, dass sie einen reduktiven Redoxzyklus durchlaufen kann, indem sie Elektronen von Fc akzeptiert (und sie dann an Ir3 + spendet). Dies liefert erste Hinweise darauf, dass Phäomelanin ein stärkeres Oxidationsmittel mit einem Redoxpotential ist, das am reduzierenden Ende durch das E ° von Fc (+0,25 V) und am oxidierenden Ende durch das E ° von Ir3 + (+ 0,55 V) eingeklammert ist.

Tabelle 1 schlägt mutmaßliche Redoxreaktionen für diese Melaninproben vor. Wir schlagen vor, dass die Redoxaktivität von Eumelanin die Oxidation von 5,6-Dihdroxyindolgruppen zu erweiterten Chinonen beinhaltet40. Wir schlagen vor, dass die Redoxaktivität von Pheomelanin mit den Benzothiazin-Gruppen von Pheomelanin zusammenhängt und mutmaßliche Reaktionen in Tabelle 141,42,43 vorgeschlagen werden.

Es ist wichtig zu beachten, dass die beobachteten elektrochemischen Reaktionseigenschaften darauf hindeuten, dass beide synthetischen Melanine redoxaktiv sind. Elektrochemische Messungen über längere Zeiträume (Abbildung S3 der Zusatzinformation) zeigen, dass diese Redoxaktivitäten stabil sind und das Melanin wiederholt oxidiert und reduziert werden kann. Somit liefert die Elektrochemie zwar keine chemischen Strukturinformationen der einzelnen Einheiten (Chinon, Halbchinon und Hydrochinon)32,44, zeigt jedoch an, dass die Verteilung zwischen diesen Zuständen in Abhängigkeit vom Umweltkontext dynamisch ist.

Schätzung des Redoxpotentials

Um erste Schätzungen der Redoxpotentiale für die synthetischen Melanine zu bestätigen, untersuchten wir die Proben mit zwei Redoxmediatoren, um Ausgangsantworten (gepaarte Verstärkung von Oxidations- und Reduktionsströmen) zu erkennen, die den Redoxzyklus charakterisieren. Nachhaltiges Redox-Cycling erfordert mindestens zwei Mediatoren und die Redoxpotentiale der Mediatoren müssen das Redoxpotential der Probe unterstützen. Somit ermöglicht dieser Test die Abschätzung des Redoxpotentials einer Probe.

Abbildung 4a zeigt die Strom-Potential-Kurven für die Phäomelanin-Chitosan- und die mit Chitosan beschichtete Kontroll-Elektrode in einer gemischten Lösung aus 100 µM Ir3+ und 50 µM Fc. Im Vergleich zur Chitosan-Kontrolle zeigt die Phäomelanin-Probe eine paarweise Verstärkung von Reduktionsströmen im Bereich D und Oxidationsströmen im Bereich C. Diese gepaarte Amplifikation legt nahe, dass Phäomelanin einem Redoxzyklus unterzogen werden kann, wobei Fc als Reduktionsmittel und Ir3 + als Oxidationsmittel dienen. Für den Fall von Eumelanin zeigt Fig. 4b zeigt keine gepaarte Verstärkung, da keine verstärkte Reduktion erkennbar ist. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Phäomelanin- aber nicht Eumelanin-Modell eine Redoxaktivität im Potentialbereich aufweist, der durch die E ° s von Ir3 + und Fc (+ 0,25 V ∼ + 0,55 V) eingeklammert wird.

Als nächstes verglichen wir die Kontroll-Chitosan- und Phäomelanin-Chitosan-Filme unter Verwendung des Fc-Ru3 + -Mediatorpaares. Abbildung 4c zeigt kleine Verstärkungen in den Reduktionsströmen in Region A (Ru3+) und Oxidationsströmen in Region B (Fc). Die paarweise Verstärkung von Oxidations- und Reduktionsströmen liefert Hinweise darauf, dass das synthetische Phäomelanin eine zusätzliche Redoxaktivität zwischen -0,2 V und +0,25 V aufweisen kann. 4d zeigt erhebliche gepaarte Amplifikationen (Ru3 + -Reduktion in Region A und Fc-Oxidation in Region B), die bestätigen, dass Eumelanin mit einem Redoxpotential zwischen -0,2 V und +0,25 V redoxaktiv ist.

Schließlich verglichen wir das Kontroll-Chitosan und die Melanin-Chitosan-Filme unter Verwendung des Ir3 + -Ru3 + -Mediatorpaares, das den größten Bereich von Redoxpotentialen (zwischen -0,2 V und + 0) überspannt.55 V). Wie unten in Fig. 4e, f, wobei der breite Redoxbereich, der durch das Ir3+ -Ru3+-Mediatorpaar untersucht wird, die engeren Redoxfenster überspannt, in denen Redoxaktivität für Phäomelanin beobachtet wurde (Fig. 4a) und Eumelanin (Fig. 4d). Da Fc aus diesem Mediatorgemisch gelöscht wurde, zeigt Fig. 4e, f zeigen, dass in Region B (Fc-Oxidation) oder Region D (Fc-Reduktion) keine Peaks beobachtet werden. Dennoch zeigten sowohl die Phäomelanin- als auch die Eumelanin-Proben starke gepaarte Amplifikationen über einen großen potentiellen Bereich, was die Schlussfolgerung, dass beide synthetischen Melanine eine Redoxaktivität aufweisen, weiter unterstützt.

Reversibilität der Phäomelanin-spezifischen oxidativen Redoxaktivität

Als nächstes konzentrierten wir uns auf die oxidative Potentialregion, um weitere Beweise für die Redoxaktivität von Phäomelanin zu liefern. Experimentell tauchten wir Melanin-Chitosan-beschichtete Elektroden in Lösungen ein, die alle drei Mediatoren enthielten, und legten den in Abb. 5a. Die anfängliche „Vorbehandlung“ (-0,4 V vs Ag / AgCl für 5 min) greift den Ru3 + -Mediator in seinen reduktiven Redoxzyklus ein, um Elektronen von der Elektrode auf die Melaninprobe zu übertragen (d. H. Um einige der redoxaktiven Einheiten zu reduzieren). Wir untersuchten dann die Probe, indem wir wiederholt das Potential zwischen -0,1 V und +0,8 V zyklierten, was ausschließt, dass der Ru3 + -Mediator weiter an den Redoxreaktionen teilnimmt (dh der Ru3 + -Mediator bleibt während dieses Sondierungsschritts „stumm“).

Abbildung 5b zeigt die Stromantwort der mit Phäomelanin-Chitosan beschichteten Elektrode auf das zyklisch auferlegte Potential, das als Standard-zyklisches Voltammagramm (CV) angezeigt wird, während Abb. 5c zeigt die Ergebnisse als Ausgangskurve (der Übersichtlichkeit halber sind die Ergebnisse für den Kontroll-Chitosan-Film nur in Fig. 5c). Es gibt zwei wichtige Beobachtungen aus diesen Plots. Zunächst wird die Verstärkung der Ir3+ -Oxidation (Region C) mit einer Verstärkung der Fc-Reduktion (Region D) gepaart. Zweitens erscheinen beide Verstärkungen im Laufe der Zeit nahezu „stetig“: insbesondere die CV-Kurven von Fig. 5b sind näherungsweise überlagerbar und die Ausgangskurven der Fig. 5c scheinen für jeden aufeinanderfolgenden Zyklus ähnlich zu sein (Anmerkung: Abbildung S4 der Zusatzinformationen zeigt, dass die Ausgabe nicht genau stabil ist, sondern dass es während jedes Zyklus einen kleinen oxidativen Nettoladungstransfer gibt). Diese nahezu stetige Amplifikation zeigt die oxidative Redoxaktivität des Phäomelanins mit Einheiten, die wiederholt oxidiert und reduziert werden können.

Die Ergebnisse mit synthetischem Phäomelanin können mit denen für synthetisches Eumelanin verglichen werden, die in Fig. 5d, e. Insbesondere ist der verstärkte Oxidationsstrom nicht mit einem verstärkten Reduktionsstrom gepaart, der eine Nettoverarmung von Elektronen aus der Melaninprobe anzeigt. Im Einklang mit dieser Erklärung steht die Beobachtung, dass die Ausgabe für Eumelanin nicht stabil ist: Die CV-Kurven überlagern sich nicht (Abb. 5d) und die Oxidationsspitzenströme werden mit jedem aufeinanderfolgenden Zyklus abgeschwächt (Fig. 5e). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Elektronen, die zunächst durch die Ru3 + -Vorbehandlung auf die Eumelaninprobe übertragen wurden, während jedes Ir3 + -Oxidationsschrittes abgereichert werden.

Dynamische Analyse: Variation der Eingangsfrequenz

Dynamische Analyse wird routinemäßig verwendet, um technologische Systeme zurückzuentwickeln. Abbildung 6a veranschaulicht, dass wir die Film-eingeschlossenen Melaninproben dynamisch untersuchten, indem wir die Frequenz des auferlegten oszillierenden Potentialeingangs variierten (Potentialbereich von -0,5 V bis + 0,8 V; Scanratenbereich 2 bis 1000 mV / s) in Gegenwart aller drei Mediatoren (Ir3 +, Fc und Ru3 +). Wie in Fig. 6a steuert die Eingangsfrequenz die Tiefe des Filmbereichs, der durch das Redox-Cycling der Mediatoren untersucht wird. Zur Analyse zeigt Fig. 6b zeigt, dass wir uns auf die Signale konzentriert haben, die mit der Fc-Reduktion (Region D) und der Fc-Oxidation (Region B) verbunden sind, und zwei Verhältnisse von Spitzenströmen verwendet haben, um die Ergebnisse zu korrelieren. Das erste Verhältnis, Verstärkungsverhältnis (AR), vergleicht die Antwort der melaninhaltigen Filme mit der Antwort des Chitosanfilms. Wie erwartet zeigt Fig. 6c zeigt, dass dieses Verstärkungsverhältnis bei niedrigeren Abtastraten größer ist, während sich dieses Verhältnis bei hohen Abtastraten 1 nähert (d.h. die probenhaltigen Filme und der Kontroll-Chitosan-Film verhalten sich ähnlich).

Das zweite Verhältnis ist ein betriebliches Maß für die Rektifikation. Abbildung 6d zeigt, dass bei hohen Frequenzen die RRFc für die beiden Melaninproben und die Chitosan-Kontrolle alle Ansatz 1 sind. Bei niedrigen Frequenzen zeigt Fig. 6d zeigt RR > 1 für Phäomelanin, aber RR < 1 für Eumelanin, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt. Insbesondere greift Pheomelanin Fc in Redox-Cycling mit Fc als Reduktionsmittel (Region D), während Eumelanin Fc in Redox-Cycling mit Fc als Oxidationsmittel (Region B) dient.

Dynamische Analyse: Imposante Stufeneingänge

Ein abschließender elektrochemischer Test wurde unter Verwendung einer Sequenz von Stufenpotentialänderungen in Gegenwart aller drei Mediatoren durchgeführt. Abbildung 7a zeigt eine Anfangsspannung von -0,4 V wurde verwendet, um Ru3 + Redox-Cycling zu initiieren, um Elektronen zu übertragen, um die Film-eingeschlossene Melaninprobe zu reduzieren. Der erste Schritt ändert sich von -0,4 auf +0.8 V können sowohl Fc als auch Ir3 + oxidiert werden und oxidative Redoxzyklen initiieren, um Elektronen vom eingeschlossenen Melanin zur Elektrode zu transportieren. Wie in Fig. 7a wurde dieses Potential 5 Minuten lang aufrechterhalten, wobei der Elektronentransfer gemessen wurde, wie in Fig. 7b. Der kumulative Ladungstransfer (nach 5 min) für den Kontroll-Chitosan-Film wurde auf eine einfache Diffusion der Mediatoren durch den Film zurückgeführt und dieser Wert wurde von dem kumulativen Ladungstransfer subtrahiert, der für die Filme gemessen wurde, die die Melaninprobe enthielten. Dieser Unterschied (QFilm) wurde dem Redox-Cycling im Film zugeschrieben und dient als Maß für die Anzahl der vom Melanin übertragenen Elektronen. Im Prinzip könnte diese Methode verwendet werden, um die gesamte Redoxkapazität der Melaninprobe zu bestimmen, jedoch ist ein Zeitraum von 5 Minuten nicht ausreichend, um Elektronen aus Partikelproben erschöpfend zu übertragen (z. B. wären mehrere Stunden erforderlich)45. Somit ist unsere berechnete Redoxkapazität (NFilm; nmol-Elektron / cm2) ein operatives Maß, das für den semiquantitativen Vergleich nützlich ist.

Abbildung 7a zeigt, dass nach dem anfänglichen Oxidationsschritt ein Reduktionsschritt von + 0,8 auf -0,4 V auferlegt wurde. Dieser Schritt ermöglicht es einem Ru3 + -Redox-Zyklus, das Melanin zu reduzieren, indem Elektronen von der Elektrode zum Melanin transportiert werden. Dieser potentielle Schritt ermöglicht auch Fc + reduktiv-Redox-Zyklus mit Phäomelanin. Abbildung 7c zeigt Ergebnisse aus diesem Reduktionsschritt und zeigt an, dass der Ladungstransfer zu beiden Melaninproben größer ist als der mit dem Kontrollfilm beobachtete Ladungstransfer. Die Fähigkeit dieser Proben, sowohl Elektronen zu spenden (Abb. 7b) und akzeptieren Elektronen (Fig. 7c) unterstützt die Schlussfolgerung, dass beide synthetischen Melaninproben redoxaktiv sind.

Abbildung 7d fasst die Ergebnisse dieser Experimente zusammen. Die Einträge in Fig. 7d sind für die Oxidationsversuche der Fig. 7b und Reduktionsversuche der Fig. 7c bzw. Die quantitativen Unterschiede der NFilm-Werte zwischen diesen Bedingungen spiegeln vermutlich kinetische Unterschiede wider. Beispielsweise ist die treibende Kraft für die Eumelaninoxidation (sowohl durch Ir3 + als auch Fc) erheblich größer als die treibende Kraft für die Eumelaninreduktion (durch Ru3 +), und dies kann den größeren NFilm von Eumelanin im Oxidationsschritt (65 nmol / cm2) im Vergleich zu seinem Reduktionsschritt (12 nmol / cm2) erklären. Ähnliche Argumente könnten die Unterschiede erklären, die zwischen der Eumelanin- und der Phäomelanin-Reduktion im zweiten Eintrag in Abb. 7d: Die treibende Kraft für die Reduktion von Pheomelanin (sowohl durch Ru3 + als auch Fc +) ist größer als für die Reduktion von Eumelanin (durch Ru3 +).

Auswertung von natürlichen Melaninproben

Als nächstes haben wir natürliche Eumelanin- und Phäomelaninproben ausgewertet, um die beiden Hauptbeobachtungen aus Studien mit den synthetischen Modellen nachzuweisen: (i) Melanin ist redoxaktiv; und (ii) Phäomelanin hat eine größere redoxbasierte prooxidative Aktivität. In diesen Studien wurden Melanin-Chitosan-Filme mit Melaningehalten von 248 µg/ml und 484 µg/ml für natürliches Eumelanin bzw. Wir tauchten die filmbeschichtete Elektrode in eine Lösung ein, die die drei Redoxmediatoren (100 µM Ir3+, 50 µM Fc und 50 µM Ru3+) enthielt, und legten unterschiedliche Potentialeingänge an. In der ersten Studie wurde ein zyklischer Potentialeingang (-0,5 bis +0,8 V vs Ag/AgCl; Abtastrate von 2 mV / s) auferlegt und Abb. 8 zeigt signifikante Verstärkungen der Oxidations- und Reduktionsströme sowohl für die Eumelanin- als auch für die Phäomelanin-Proben. Die gepaarte Verstärkung von Oxidations- und Reduktionsströmen unterstützt die erste Schlussfolgerung, dass beide natürlichen Melanine redoxaktiv sind und zwischen reduziertem und oxidiertem Zustand umgeschaltet werden können.

Interessanterweise ist die charakteristische Signatur der synthetischen Phäomelanin – Amplifikation im D-Bereich in Fig. 3 – ist bei der natürlichen Phäomelaninprobe nicht ersichtlich. Möglicherweise spiegelt eine Abschwächung dieses charakteristischen D-Peaks die gemischte polymere Natur der natürlichen Melanine wider. Ein experimenteller Ansatz, um dieser gemischten polymeren Natur Rechnung zu tragen, besteht darin, das Verhalten natürlicher Melaninproben mit einer Mischung synthetischer Melanine46,47,48 zu vergleichen. Für unsere Studie, Wir bereiteten Filme vor, die Mischungen aus synthetischem Eumelanin und Phäomelanin enthielten, und untersuchten diese Filme mit drei verschiedenen Potentialeingängen, wie in den oberen Feldern in Abb. 9 (weitere Einzelheiten siehe Abbildung S5 der Zusatzinformation). Wie durch die Mitteltafeln in Fig. 9 wurden die Ausgänge analysiert, indem die Ströme integriert wurden, um die während der Reduktion (QRed) und Oxidation (QOx) übertragene Gesamtladung zu bestimmen und dann ein Reduktions-Oxidations-Verhältnis (Redox-Verhältnis) zu erzeugen. Es wird erwartet, dass eine Probe mit größerer redoxbasierter Prooxidationsaktivität ein höheres Redoxverhältnis aufweist, da sie mehr Elektronen aus der Elektrode ziehen würde.

Im ersten Test führten wir eine zyklische Voltammetrie durch (z. B. wie in Abb. 8) und analysierte die Ergebnisse, wie durch die obere Platte in Fig. 9a. Für die synthetischen Melaningemische ergeben sich die Ergebnisse in der Bodenplatte der Fig. 9a zeigen einen linearen Anstieg des Redoxverhältnisses mit dem Anteil an synthetischem Phäomelanin. Dieser beobachtete Trend wird von der größeren prooxidativen Aktivität von synthetischem Phäomelanin erwartet. Überlagert mit dem linearen Plot in Fig. 9a sind horizontale Linien für die Ergebnisse aus den natürlichen Melaninproben, die zeigen, dass das Redoxverhältnis für Phäomelanin größer ist als das für Eumelanin. Interessanterweise legt der Schnittpunkt der horizontalen Linie für Phäomelanin mit den Ergebnissen aus den synthetischen Mischungen nahe, dass der Gehalt an Eumelanin in der natürlichen Phäomelaninprobe ungefähr 40% beträgt, was mit der chemischen Analyse von rotem menschlichem Haar übereinstimmt39.

Im zweiten Test wurde die obere Platte in Abb. 9b zeigt, dass wir jeder der mit Melaninfilm beschichteten Elektroden 5 min lang schrittweise Potentialeingänge auferlegt und den Ladungstransfer sowohl für den schrittweisen Wechsel zu den reduzierenden als auch zu den oxidierenden Bedingungen gemessen haben (analog zu Experimenten in Fig. 7). Die Darstellung in Fig. 9b zeigt wiederum, dass für die synthetischen Melaningemische das Redoxverhältnis linear mit dem Anteil an synthetischem Phäomelanin anstieg. Die Ergebnisse für die natürlichen Melanine (horizontale Linien) zeigen wiederum, dass das Redoxverhältnis für Phäomelanin größer ist als für Eumelanin.

Der abschließende Test wurde durchgeführt, indem das Potential 10-mal zwischen -0,1 V und 0,8 V gefahren wurde, um den stärker oxidativen Redoxpotentialbereich zu untersuchen (analog zu Experimenten in Abb. 5). Wie durch die mittlere Platte in Fig. 9c, wir gemittelt die ladung übertragen von letzten drei zyklen und berechnet die Redox Verhältnis. In Übereinstimmung mit den beiden vorherigen Tests stieg das Redoxverhältnis linear mit dem Anteil an synthetischem Phäomelanin im Film an, und das natürliche Phäomelanin hatte ein höheres Redoxverhältnis als natürliches Eumelanin.

Zusammenfassend sind die Ergebnisse für die natürlichen Melanine qualitativ konsistent mit denen für die synthetischen Modelle: Die Melanine sind redoxaktiv und Phäomelanin hat eine größere redoxbasierte prooxidative Aktivität.